角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究△

黎颖莉 席兴华 Tomoyuki-Inoue Fumihiko-Takamatsu Naoyuki-Maeda Yuichi-Ohashi Kohji-Nishida

干细胞niche是一种由细胞和细胞外成分组成的特殊微环境，包括特殊的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和分泌的细胞因子。认识和了解干细胞niche对于研究niche调节干细胞的功能与自我更新以及再生医疗临床的应用都有着重要作用[1-4]。角膜缘niche位于角膜缘上皮基底膜下的浅层基质，解剖部位与角膜缘基底细胞邻近，因其位置表浅，易于分离，是成体干细胞微环境调控研究的理想模型。有研究将角膜缘niche细胞(limbal niche cells，LNCs)分离出并发现其具有通过基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体CXCR4(SDF-1-CXCR4)信号通路维持角膜缘干细胞生长的特性[5-7]。也有研究表明，位于角膜缘基质的角膜缘基质细胞(limbal stromal cells，LSCs)同样能支持角膜缘干细胞增殖[8-9]，甚至诱导毛囊干细胞和胚胎干细胞分化成角膜上皮样细胞[10-11]，证明LSCs可能对角膜缘干细胞微环境有着重要作用。因为LNCs和LSCs解剖部位邻近，且都有支持角膜缘干细胞生长的特性，在研究中常常被学者们混为一谈，而更好地区分LNCs和LSCs对于将来深入研究和了解角膜缘干细胞niche的结构和功能有着十分重要的意义。因此在本次实验中，我们分离并比较了LNCs和LSCs的基因表型以及两者作为饲养细胞支持单细胞克隆形成、上皮细胞复层化和维持角膜上皮干细胞特性的能力。

1 材料与方法

1.1 角膜缘干细胞、LNCs和LSCs的分离与培养实验中采用的6个角膜供体均从Northwest Lions (Seattle,WA)眼库获得。行板层角膜移植术后剩下的角膜片，撕去内皮层后用2400 U·L-1Dispase溶液(BD Biosciences,Bedford,美国) 37 ℃水浴消化 1 h，再用含体积分数0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Nacalai Tesque,Kyoto,日本)室温下孵育 2 min。用无菌手术镊沿着角膜缘将上皮细胞刮下，收集的细胞用2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA(Nacalai Tesque,Kyoto,日本)在37 ℃环境下孵育15 min，得到的细胞悬液用改良的角化细胞培养基(keratinocyte culture medium，KCM)培养，以获得原代角膜缘干细胞。改良的KCM成分为： DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium)、Ham’s F12培养基(DMEM/F12,31)、体积分数5% 胎牛血清(FBS),1 nmol·L-1霍乱毒素(Calbiochem,La Jolla,美国)、2 nmol·L-1三碘甲状腺原氨酸 (Takeda,Osaka,日本)、0.4 g·L-1氢化可的松(Kowa,Tokyo,日本)、10 g·L-1胰岛素-转铁蛋白补硒、10 μg·L-1人重组表皮生长因子(Sigma,St.Louis,美国)、100×103U·L-1青霉素以及100 g·L-1链霉素。收集到的细胞悬液加入KCM培养液，培养到10～14 d，当角膜上皮克隆周围成纤维样细胞出现时，将上皮细胞刮去，选择性保留成纤维样细胞，得到的即为原代LNCs。LSCs细胞培养：将角膜缘组织除去前基质层(含残余上皮细胞)和后基质层(含角膜内皮细胞)后铺在含体积分数10% FBS-DMEM培养基中培养，可得到从组织中增殖爬出的LSCs。LNCs和LSCs均置于含体积分数10%FBS-DMEM培养基中，在含体积分数5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，每3 d换液一次。LNCs和LSCs的比较在同片角膜分离得到的细胞间进行，结果进行三次实验取平均值。

1.2 饲细胞层的制备为比较不同饲细胞支持角膜缘干细胞增殖的能力，LNCs和LSCs(均为第二代细胞)以及小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH/3T3)三种细胞分别用加入8 g·L-1丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)的培养基在37 ℃培养2 h去有丝分裂活性。细胞浓度为20×103个·cm-2、15×103个·cm-2、10×103个·cm-2、8×103个·cm-2和 5×103个·cm-2的LNCs和LSCs饲细胞克隆形成实验比较后发现，8×103个·cm-2细胞密度接种的饲细胞组克隆形成率(colony-forming efficiency,CFE)最高，因此，选择此浓度用于后续实验。三种细胞用PBS洗3次，胰蛋白酶消化后，LNCs和LSCs按8×103个·cm-2的细胞密度，NIH/3T3按20×103个·cm-2的细胞密度接种于6孔细胞培养板或者铺有I型胶原凝胶的Transwell小室作为饲细胞层。

1.3 角膜缘干细胞克隆形成实验将原代角膜缘干细胞按照每孔1000 个的密度接种于覆盖有LNCs、LSCs、NIH/3T3三种饲细胞层的6孔板，共培养10～13 d。终止培养后，用体积分数10%中性福尔马林固定，10 g·L-1罗丹明B (Wako,Osaka,日本)染色。CFE=克隆数/接种活细胞数×100%。

1.4 角膜上皮细胞片的制备将原代角膜缘干细胞按每孔100×103～200×103个的密度分别接种于含有LNCs、LSCs、NIH/3T3三种饲细胞层的胶原凝胶涂层的Transwell小室。细胞在KCM培养基中培养12 d后，降低液平面培养6 d促进角膜上皮复层化。每2 d换液一次。

1.5 逆转录PCR及定量PCR步骤按RNeasy Mini Kit (Qiagen,Valencia,美国)试剂盒使用说明书提取各组织和细胞的总RNA。采用1st Strand cDNA Synthesis System (Origene,Rockville,美国) 进行逆转录翻译，合成PCR所需的cDNA。PCR热循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃延伸30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。用20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，紫外投射成像系统观察，凝胶图像分析软件分析目的基因的相对含量。本研究参考文献选取了一些与支持角膜缘干细胞生长相关的基因[12-15]，检测其在LNCs和LSCs的表达情况。各种基因的表达均使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参进行标准化。定量PCR使用Taqman®荧光定量PCR法，采用Applied Biosystems 7900 HT(Applied Biosystems,Foster City,美国) 序列检测仪进行检测与分析。ΔNp63 (Hs00978339_m1)、keratin 3 (K3) (Hs00365080_m1)、GAPDH (Hs99999905_m1)序列均购买于Applied Biosystems公司。反应条件为：95 ℃ 预变性10 s；95°C变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共45个循环。量化数据用GAPDH作为内参标准化后，用序列检测系统软件(Applied Biosystems)进行分析。结果进行三次实验取平均值。

1.6 免疫荧光染色收获的角膜上皮再生细胞片包埋，行6～8 μm厚度冰冻切片用于免疫荧光染色。免疫荧光染色操作：切片用40 g·L-1多聚甲醛在4 ℃下固定30 min，40 g·L-1脱脂牛奶PBS溶液(含体积分数0.3% Triton X-100)室温1 h封闭非特异结合，之后加入一抗：anti-K3 (AE5) (1100,Progen Biotechnik,Heidelberg,德国)、anti-keratin12 (1100,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,美国)、anti-P63 (4A4) (1100,Santa Cruz)，4 ℃孵育过夜。然后用PBS洗3遍，每遍5 min，加入相应的二抗常温孵育1 h。再用PBS洗3遍，最后加DAPI染细胞核，在Zeiss 荧光显微镜下观察。加入相同浓度非特异性抗体的切片作为阴性对照。角膜缘niche组织结构HE染色按照常规方法进行。上皮细胞片免疫荧光染色图像信号采用NIH ImageJ软件量化。同一样本选取三张不同的免疫荧光照片进行量化计算，并计数细胞核数目。相对荧光强度=总荧光强度/总细胞数。结果取三组数据的平均值表示。

1.7 统计学分析所得数据均采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。采用单一样本方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 LNCs和LSCs的分离与培养经消化和机械分离收集的角膜缘细胞混合液接种到培养板，在无饲细胞的KCM培养基下培养以得到LNCs。培养到第7天，典型的角膜上皮细胞克隆开始形成，到10～14 d，许多成纤维细胞样间充质细胞围绕克隆周围出现。LNCs在将上皮细胞克隆机械刮除后用胰蛋白酶消化分离传代。而LSCs是用消化、分离上皮层后剩余的组织块进行培养得到的。为防止基底上皮层细胞混入niche细胞，实验仅使用中间部分的角膜基质层。3～5 d后LSCs从组织中迁移出来，传代培养行后续实验。

2.2 LNCs组、LSCs组、NIH/3T3组角膜缘干细胞克隆形成与干细胞特性角膜缘干细胞与LNCs、LSCs、NIH/3T3三种饲细胞进行共培养，比较三者在维持角膜缘干细胞生长能力上的差异。结果显示，在10～13 d，三组细胞均形成了典型的上皮细胞克隆，见图1；然而LSCs组CFE(图1C)低于LNCs组(图1B) 和NIH/3T3 组(图1A)。与LNCs组(图1E)相比，NIH/3T3组(图1D)形成的细胞克隆显示高分化上皮细胞形态，而LSCs组(图1F)形成的克隆小细胞数少，边缘轮廓皱褶，形状高度不规则。各组CFE定量分析显示，LNCs 组CFE(6.57±1.54)%和 NIH/3T3 组CFE(10.57±1.46)%明显高于LSCs组CFE(1.43±0.47)%(图1G)。此外，免疫荧光染色和mRNA半定量分析显示，见图2，NIH/3T3组较高表达角膜上皮细胞分化标记物K3(图2A、2C)，而LNCs组较高表达角膜缘干细胞标记物ΔNp63(图2B、2D)。

图1 克隆形成实验 A～C为直视下所见图，D～F为显微镜下所见图。A、D：NIH/3T3组；B、E：LNCs组；C、F：LSCs组，G为三组CFE比较柱状图。组间比较，*P<0.05

图2 角膜缘干细胞克隆特征 A：K3免疫荧光染色图；B：ΔNp63免疫荧光染色图；C：K3 mRNA半定量分析图；D：ΔNp63蛋白mRNA半定量分析图。组间比较，*P<0.05

2.3 LNCs组、LSCs组、NIH/3T3组角膜上皮细胞片特征经过3周共培养，LNCs组、LSCs组、NIH/3T3组均形成了复层角膜上皮细胞片，见图3。形态学观察表明，NIH/3T3组和LNCs组角膜缘干细胞形成4～5层复层上皮细胞，而LSCs组形成的角膜上皮细胞仅有2～3层(图3A)。免疫荧光染色结果显示，NIH/3T3组角膜上皮细胞片表达较高的K3阳性染色(图3B、3E)，且角膜缘干细胞标记物ΔNp63染色仅在基底层细胞，而LNCs组上皮细胞片在基底细胞和翼细胞均高表达ΔNp63(图3C、3F)。三组共培养的角膜上皮细胞角蛋白K12染色相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图3D、3E)。

图3 体外培养的角膜上皮细胞片特性 A：角膜上皮细胞片HE染色图；B：角膜上皮细胞片K3免疫荧光染色图；C：角膜上皮细胞片ΔNp63免疫荧光染色图；D：角膜上皮细胞片K12免疫荧光染色图；E：K3、K12蛋白细胞内相对荧光强度；F：ΔNp63蛋白阳性细胞率。组间比较，*P<0.05

2.4 逆转录PCR分析LNCs组与LSCs组表型特征逆转录PCR分析表明(图4)，体外培养的LNCs和LSCs表达波形蛋白Vimentin，但不表达角膜上皮细胞标记物角蛋白K3和结膜细胞标记物角蛋白K4，表明这两种细胞未受角膜上皮细胞和结膜细胞污染。结果表明，LNCs和LSCs均表达表皮成纤维细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、表皮调节素(EPR)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)以及输入蛋白13(IPO13)。然而，LNCs与LSCs相比，较低表达神经营养素3(NT3)，显著高表达上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)(均为P<0.05)。

图4 LNCs组和LSCs组各种蛋白基因逆转录PCR产物电泳结果 Vim：波形蛋白;NT：空白对照

3 讨论

角膜缘干细胞公认分布在角膜缘Vogt栅栏样结构内[16]。角膜缘上皮细胞基底膜下的角膜基质层内的细胞是否具有异质性尚缺乏研究。最近，有学者[5-7]研究发现LNCs位于角膜缘上皮基底层且具有维持角膜缘干细胞的特性。我们在角膜缘干细胞培养实验中也发现，中性蛋白酶处理后的角膜组织经过强烈机械力分离得到的角膜缘干细胞可以获得更多克隆。在先前的实验中我们观察到，角膜缘干细胞单独培养在KCM培养液中一段时间后，角膜上皮克隆周围会有Vimentin阳性成纤维细胞样间充质细胞增生。考虑到角膜缘细胞间的相互联系，这些成纤维细胞样细胞围绕着上皮细胞克隆长出，极可能是LNCs。尽管LNCs和LSCs有着相似的细胞形态和基因表型[6,17]，但是为了避免niche细胞污染，我们仅选用角膜缘基质的中间层进行实验。因此，可能去除了一些最有效的邻近基底细胞层的LSCs，从而降低了LSCs对角膜缘干细胞的支持能力。同时需要提到的是，本实验使用的培养基含有胎牛血清，血清可能促进了LNCs和LSCs的分化[18]，因此本实验仅选用第二代细胞作为饲细胞进行研究。

我们发现，LNCs与LSCs相比具有更强的维持角膜缘干细胞生长的能力，可以维持上皮细胞表达更多干细胞标记物，形成更多上皮克隆与复层化角膜上皮细胞片。研究结果显示，LNCs组形成了4～5层复层角膜上皮细胞片，而LSCs组仅形成2～3层复层细胞。LNCs组细胞片主要在浅表细胞层表达角膜上皮分化标记物K3。而且与NHI/3T3组相比，克隆形成实验和细胞片培养实验中收集到的上皮细胞均显示较低表达K3。上皮克隆的免疫组织化学染色和mRNA定量实验显示，LNCs组比NHI/3T3组在基底细胞层和翼细胞层表达更多ΔNp63阳性细胞，这表明LNCs比LSCs和NHI/3T3细胞能更有效地维持角膜缘干细胞的干细胞特性。因此，我们认为LNCs既能有效支持角膜缘干细胞增殖，又能很好地维持角膜缘干细胞在体外的未分化特性。

本实验将LNCs和LSCs置于适合成纤维细胞生长，不适合角膜上皮细胞生长的体积分数10% FBS-DMEM培养液中培养，分离出的细胞显示成纤维细胞样形态，角膜上皮分化标记物K3、结膜上皮标记物K4表达阴性，确保LNCs和LSCs没有被角膜上皮细胞和结膜上皮细胞污染。此外，逆转录PCR结果显示，LNCs和LSCs均表达多种生长因子(EGF、 FGF2、EPR、HGF、KGF、NGF、GDNF和 BDNF)和潜在的角膜上皮干细胞标记物N-cadherin和IPO13[19]。然而LNCs较高表达E-cadherin，而较低表达NT3。生长因子对角膜上皮的更新和损伤修复均有着重要作用[20]，其中大多数由成纤维细胞通过旁分泌的方法作用于上皮细胞受体刺激细胞增殖和分化[12-15]。我们的研究证实了LSCs和LNCs均分泌多种生长因子。尽管LSCs比LNCs高表达NT3，但是因为角膜缘干细胞上NT3受体TrkC表达少[21]，因此NT3对角膜缘干细胞作用不强，这与我们研究结果一致。钙黏蛋白介导细胞与细胞之间的黏附，在胚胎发育过程中起着重要作用，对组织形成、细胞生长和分化起着重要作用[22]。研究发现，N-cadherin对造血干/祖细胞和角膜缘干细胞与niche细胞之间相互作用起着重要影响[23]。角膜缘干细胞分泌的N-cadherin因子就像一个分子锚，将角膜缘干细胞与N-cadherin阳性表达的niche细胞锚定、黏附。LNCs分布在角膜缘上皮基底层，表达N-cadherin蛋白，它们可能通过与角膜缘干细胞侧面细胞膜上的N-cadherin和E-cadherin锚定，对角膜缘干细胞直接作用，在胚胎期起到将间充质细胞转化为角膜上皮的作用[24]，并且对调节上皮创面愈合时集合定向移动大上皮片发挥重要作用[25]。值得注意的是，LNCs与LSCs 相比较高表达E-cadherin，这可能解释了为何LNCs能更好地支持角膜上皮增殖。需要指出的是，LNCs在富含血清的培养基中培养长时间后可能会分化。有研究报道，一种改良的胚胎干细胞培养基可以维持niche细胞未分化状态，维持其表达胚胎干细胞标记物[6]，将来进一步的实验需要将LNCs和LSCs在这种改良胚胎干细胞培养基条件下进行培养、比较。

综上所述，本研究报道了一种新的分离角膜缘niche细胞方法，比较了LNCs和LSCs在支持角膜缘干细胞生长、角膜上皮细胞片再生，以及两种细胞基因表型的区别。本研究结果显示，LNCs在将来可能成为治疗角膜缘干细胞缺乏的首选。

致谢：感谢周庆军博士(山东眼科研究所，中国青岛)和Dr.Hayashi Rhyhei(日本大阪大学)对本文的完善与指导！