富血小板血浆对MRSA的体外抑菌作用研究

吴日钊 霍景山 刘海燕 张伟霞 钟婉婷

1.广东省佛山健翔医院普通外科，广东佛山 528000；2.广东省佛山市中医院外一科，广东佛山 528000；3.广东省佛山健翔医院检验科，广东佛山 528000；4.广东省佛山市中医院检验科，广东佛山 528000

富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）是近年热门探讨的生物疗法技术，是通过离心全血而获得的含有高浓度血小板的血浆，将其与凝血酶-钙剂按比例混合可制成血小板凝胶[1]（platelet gel，PG）。高浓度血小板激活后可释放大量生长因子[2]，目前主要用于慢性创面修复[3]、骨与软组织再生[4]、整形美容方面[5]的研究。笔者临床用PRP 制成PG 修复反复感染的难治性慢性创面时，发现创面感染状况改善，思考PRP 具有抑菌作用。故笔者拟通过PRP 对慢性创面常见的难治的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行体外抑菌实验研究，为进一步探讨PRP 治疗慢性创面提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器与试剂 全自动血细胞分析仪（迈瑞5380），数显恒温水浴箱（金坛科析HHW600），全自动洗涤离心机（上海耐圣卡兰 XTL-417W），一次性无菌真空采血管（苏州康健），麦氏比浊仪（北京中瑞祥ZRX-29417），营养琼脂培养基（北纳生物），PBS 磷酸缓冲盐溶液（海标科技1000mL）。

1.1.2 菌株 标准耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株 （MRSA，ATCC 43300）购自北京中科质检生物技术公司。

1.2 研究对象

本研究经医院伦理委员会讨论通过。2019年3 ～8 月在广东省佛山市内征集24 例健康志愿者，男12 例，女12 例，年龄20 ～35 岁，平均（26.1±4.1）岁。纳入标准：（1）志愿者知情同意并签署伦理同意书；（2）3 个月内未使用抗生素；（3）实验2 周内血常规：白细胞（4.0 ～10.0）×109/L，血小板（100 ～300）×109/L。排除标准：（1）合并严重心肝肾功能障碍；（2）合并血液系统相关疾病。

1.3 实验方法

1.3.1 PRP、PPP 与PG 的制备 每位志愿者均抽取外周静脉血25mL。全血经两次差速离心获得PRP与PPP（platelet-poor plasma，贫血小板血浆），两次离心的条件[6]分别为：20℃，1500r/min、时间10min和3200r/min、时间8min。将凝血酶冻干粉溶于10% CaCl2制成终浓度1000U/mL 凝血酶-CaCl2激活剂，与PRP 以1 ∶10 混合制成PG。

1.3.2 体外抑菌实验

1.3.2.1 转菌 本实验在佛山市中医院临床实验室严格无菌下进行。MRSA 菌株接种于营养琼脂培养基上，37.0℃恒温箱培养24h。

1.3.2.2 配管 将1mL 菌株接种至含4mL PBS 的无菌试管中，充分混悬。以0.5 麦氏单位比浊致终浓度为1.0×106cfu/mL，取5 支无菌干燥试管注入0.1mL 菌液。分别取制备的PRP、PPP、PG 及全血、PBS 注入此5 支试管内，并以注入的成分命名分组。PRP 组注入0.5mL PRP 和0.4mL PBS，PPP 组注入0.5mL PPP 和0.4mL PBS，PG 组加入0.55mL PG 和0.35mL PBS，全血组加入0.5mL 含抗凝剂全血和0.4mL PBS，PBS 组（对照组）加入0.9mL PBS。

1.4 观察指标

（1）用血细胞分析仪检测PRP、PPP 及全血的白细胞、血小板含量。（2）菌落计数：五组试管置入37℃恒温箱中孵育，间隔0、2、4、6、8、12、24h 分别 取0.1mL 样 本，用0.9mL PBS 做3 次l ∶10 系列稀释，取100μL 样本点种于血琼脂平板后，置37.0℃恒温箱培养24h，最后计数菌落数。所获数据用时间-菌落浓度曲线图表示。（3）抑菌率。抑菌率[7]＝（对照组平均菌落数-实验组平均菌落数）/对照组平均菌落数×100%。

1.5 统计学处理

采用统计学软件SPSS22.0 对数据进行统计分析。计量数据以（）表示；由于菌落计数不成正态分布，因此取其对数转化使之基本符合正态分布。白细胞和血小板计数、抑菌率的组间比较采用t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义；P ＜0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 白细胞及血小板含量计数

全血中白细胞与血小板含量计数分别为（6.642±1.288）×109/L 和（183.816±43.004）×109/L。所得的PRP 中分别为（16.018±3.224）×109/L 和（1013.142±155.822）×109/L，与全血比较白细胞含量计数差异有统计学意义（P ＜0.05）；所 得 的PPP 中 分 别 为（0.416±0.208）×109/L 和（19.223±4.038）×109/L，与全血比较差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

2.2 各组各时间点的MRSA菌落计数

各组在不同时间点对MRSA 的菌落浓度计数结果如图1 所示。培育开始阶段，PRP 组、PG 组的菌落

表1 二次离心后取PRP、PPP及全血的白细胞、血小板含量（，×109/L）

表1 二次离心后取PRP、PPP及全血的白细胞、血小板含量（，×109/L）

白细胞含量 血小板含量组别PRP组 PPP组 PRP组 PPP组PRP/PPP组 16.018±3.224 0.416±0.208 1013.142±155.822 19.223±4.038全血组 6.642±1.288 183.816±43.004 t 18.112 22.524 25.104 18.724 P ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 PRP组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

表2 PRP组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

组别 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PRP组 14.493±1.813 29.630±4.587 25.882±2.787 15.294±1.508 12.791±4.192 7.865±3.821 149.780 ＜0.01 PG组 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 9.532 8.842 7.449 5.679 1.890 1.922 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

表3 PPP组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

表3 PPP组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

组别 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PPP组 5.797±1.432 2.469±0.754 4.706±0.622 2.353±0.338 2.326±0.527 1.124±0.435 122.898 ＜0.01 PG组 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 17.296 26.438 24.029 17.119 11.547 7.286 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 全血组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

表4 全血组与PG组在不同时间对MRSA的抑菌率比较，%）

组别 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P全血组 7.246±1.225 16.049±2.724 17.647±1.912 9.412±1.688 3.488±1.323 3.371±1.128 293.568 ＜0.01 PG组 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 16.335 15.483 13.634 10.253 9.959 5.538 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

浓度呈现呈现先下降后上述趋势，至4h 达到最低点，此时间点的菌落计数最少，抗菌效果最明显，随后菌落浓度开始上升，两组组均至12h 后菌落浓度上升趋势进入相对平稳期。PPP 组与PBS 组的菌落浓度在培育开始阶段即呈对数上升趋势，全血组成缓慢上升趋势，此三组菌落浓度同样于12h 后趋向于平稳。上述说明菌落计数有随时间变化趋势呈负相关。含有高浓度血小板的组别（PRP 组、PG 组）的菌落计数在各时间点均低于另外三个组别（全血组、PPP 组、PBS 组），即含有高浓度PRP 组具有抗菌性。且PG 组与PRP 组的对比中，12h 内PG 的抗菌性优于PRP，12h 后PG 组与PRP 组细菌生长趋向稳定。

图1 不同时间点对MRSA 的菌落浓度曲线图

2.3 各组对MRSA的抑菌率

含 有 高 浓 度PRP 的 组 别（PG 组、PRP 组）对MRSA 的 抑 菌 率 在12h 内 明 显，并 在4h 时抑菌率最强；其中PG 组平均抑菌率达到了（41.975±5.121）%，与PRP 组的（29.630±4.587）%比较差异有高度统计学意义（P ＜0.01），与其他三组比较差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）。4h后含有高浓度PRP 的两组的抑菌率均逐渐降到最低状态。含有高浓度PRP 的PG 组、PRP 组的抑菌作用始终依次高于全血组、PPP 组，并在12h 内抑菌率差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表2 ～4。

3 讨论

基于富血小板血浆（PRP）含有多种高浓度的生长因子，近年国内将此生物疗法技术广泛应用于普通外科、骨科、烧伤整形科等多个学科领域。随着应用的开展，渐多的文献报道[8-9]PRP 可能具有抑菌活性，这与笔者临床应用PRP 修复慢性创面的临床观察结果一致。

笔者观察到在本实验结果中，PRP 的血小板含量约为全血的5.5 倍，白细胞含量为全血的2.4 倍，理论上是有一定的抑菌作用的，同时抑菌率数据显示其与血小板浓度呈正相关性。白细胞中的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，是已被确认的在人防御机制中发挥了重要的作用。白细胞在PRP 的制备过程中大部分没有被破坏，其重要的抗病原体活性得以保持[10]。髓过氧化酶（MPO）存在于中心粒细胞中，其被病原体等激活和脱颗粒后，生成具有高度杀菌活性的次氯酸和活性氧衍生物，对病原体进行杀伤；同时中心粒细胞内为含有多种水解酶的溶酶体，具有消化病原体及异物的作用。单核细胞进入组织后转化为可以吞噬致病物质的巨噬细胞，并催化产生活性氧代谢物，杀灭病原体[11]。而淋巴细胞则通过免疫应答作用来发挥抑菌作用。血小板是PRP 中含量最丰富的细胞成分，早在1992年Yeaman 等[12]就发现它具备抑菌活性，报道显示血小板可在体外直接黏附和清除细菌、真菌，同样也能增强血液中病原微生物的清除率。另一研究发现[13]，血小板激活后除了可释放大量生长因子加速软组织修复外，同时具有与中性粒细胞等共同的结构和功能，如lgG 的Fe 受体、CD36 抗原等受体。激活后的血小板，其表面的受体能促进吞噬细胞对病原体的内化作用；血小板亦可产生过氧化物、羟基自由基和过氧化氢等抑菌氧化代谢产物，直接黏附和内化病原体。血小板裂解后能释放有效的抗菌肽，大多数研究认为抗菌肽是血小板的主要抗菌因子，具有直接抗菌作用。Tang 等[14]证实了这一点，其研究显示血小板激活后可释放7 中抗菌肽，并表明其具有直接的抗菌特性。另外，血小板碱性蛋白已被证实除了作为CXC 趋化因子的信号作用，还有对抗病原体的作用[11]。基于PRP 的抑菌活性，学者开始探讨PRP 对病原菌的抑菌实验作用。赵连前等[15]报道了不同血小板浓度的富血小板凝胶具有抑制金黄色葡萄球菌的作用。

笔者结合本实验结果，观察到含有高浓度PRP的PG 组、PRP 组的菌落计数在各时间点均低于另外三个组别，发现PRP 的抑菌作用随血小板的浓度增加而增加，可能由于抗菌肽的释放越多，抑菌作用越强，这说明PRP 抑菌作用具有浓度依赖性。PG 组、PRP 组对MRSA 的抑菌作用在12h 内明显，并以第4h 最强，12h 后逐渐减弱，可能由于抗菌肽的消耗，抑菌作用减弱，细菌呈现对数繁殖，这表明PRP 抑菌作用具有时效性。笔者另观察到，PG 组的菌落计数亦低于高于PRP 组，考虑PRP 组中的未加入凝血酶，抑菌成分未完全释放，故在本实验中抑菌作用较PG 低。PPP 组仅含有极少量的血小板与白细胞，故其与对照组（PBS 组）相仿，基本不呈现抑菌活性。全血组中的白细胞与血小板量介于PRP 组与PPP 组之间，考虑白细胞作用与血小板释放一定量的抑菌成分相关，菌落浓度曲线图结果呈现符合此中界结果。

本实验有关PRP 的抑菌作用、时效性的结果与笔者临床中运用PRP/PG 修复慢性创面的临床观察结果基本吻合。笔者临床中观察中慢性褥疮创面运用PRP/PG 除了其创面体积明显缩小以外，使用PRP/PG 的24h 内创面周围红肿热症状较术前改善，且整个治疗周期中，创面渗出量、渗出液性质均较未使用PRP 时期好转，故笔者在实际病例中减少了使用抗菌药物辅助治疗。由此，笔者进一步认为在慢性创面中PRP 与使用抗菌药物相比更具优势，主要表现在以下5 个方面：（1）PRP 在促进组织修复的过程中发挥的抑菌作用，这均属于PRP 的自身功能，两者可能存在协同的作用；（2）PRP 发挥抑菌作用的机制有别于抗菌药物，故病原微生物产生耐药性的可能性极低；（3）基于PRP 具有抑菌作用，可探讨减少使用抗菌药物的时长、剂量，甚至降级使用抗菌药物的可能性；（4）PRP 在创面形成PG 黏附于创面表面，可一定程度上阻碍病原微生物进入创面，减少病原微生物的新增量；（5）PRP 源于自身血液提取获得，可避免过敏反应、排斥反应及传染性疾病的发生。

目前，PRP 主要用于软组织的修复方面，随着更多研究抑菌作用的证实，其也逐渐用于感染创面的处理，张宏亮等[16]报道PRP 与NPWT 联合应用于难治性感染创面具有较好的抑菌效果，能够提高机体EPO 水平，促进伤口愈合。由此，笔者认为可进一步探讨PRP 的抑菌作用作为传统使用抗菌药物的一种有效补充，作为预防和治疗例如关节感染、慢性创面感染等PRP 治疗领域的一种补充手段。但由于时间及条件的限制，本实验研究仍存在一定的不足之处，如本实验对象是健康人群、使用的是外购的MRSA 标准菌株，与合并多种慢性疾病的人群、与临床分离菌株、创面多种菌群存在的复杂情况存在差异，下一步笔者将选取临床患者或更多的菌群进一步探讨PRP 的抑菌作用及临床应用来加以佐证。