外周血TAP联合HPV、TCT在宫颈癌筛查中的应用

王 蕾 夏 红 罗玉辉 陈体辉 李 雪 凡利敏

早期宫颈癌预后较好，5年生存率在92%左右，原位癌甚至可达100%[1]，因此尽早通过筛查宫颈病变，建立科学有效的宫颈癌防治体系至关重要。液基薄层细胞学检查(TCT)在宫颈癌筛查方面应用已有较长历史，且通过涂片质量优化，其诊断灵敏度获得较大提升[2]；随着人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌之间因果关系的确立，而聚合酶链反应(PCR)实时荧光技术的出现也令病毒DNA鉴别的简易性与精确性维持在较高水平[3]，故HPV分型检查也成为宫颈癌筛查的重要环节，且与TCT联用提高诊断准确性已被临床所广泛认同[4]。肿瘤异常蛋白(TAP)是近年来肿瘤领域研究的热点，已证实与乳腺癌、肺癌、胃肠癌等病理进展机制之间存在密切联系[5-7]，对此，本研究旨在分析外周血TAP、HPV分型诊断、TCT分别及联合应用于宫颈癌筛查的可行性与诊断效能，现将取得成果作如下报告。

1 材料与方法

1.1 一般资料

对2019年1月至2019年3月期间，于我科确诊的110例宫颈病变患者临床资料进行回顾性分析。纳入标准：阴道镜检查发现宫颈病变；年龄20～80岁；有性生活史；1周内完成宫颈组织活检、外周血TAP、HPV分型检查及TCT。排除标准：诊断出其他部位良恶性肿瘤或HPV感染；妊娠期女性；伴有盆腔严重感染；检查前1周内有阴道用药、物理治疗史或3 d内有性生活、阴道冲洗史；既往存在妇科手术史。患者受检时年龄为24～75岁，平均(47.52±13.86)岁；初次性生活年龄16～23岁，平均(19.73±1.54)岁；孕次为1～7次，平均(3.28±0.74)次；产次为0～3次，平均(1.65±0.39)次。根据宫颈组织学活检结果将7例宫颈癌患者、39例鳞状上皮内高度病变(HSIL)患者纳入危险组(n=46)，将37例鳞状上皮内低度病变(LSIL)患者与27例慢性宫颈炎症患者纳入对照组(n=64)。

1.2 外周血TAP水平测定方法

常规采集患者空腹状态下指尖血20 μl，均匀涂片≥2/3玻片长度，置于水平工作台室温18 ℃～25 ℃环境下自然风干；采用TAP检测试剂盒(联科生物MultiSciences公司提供)，按照试剂盒说明书指示，向玻片垂直滴加凝聚助剂3滴，形成3个斑点，自然风干；采用肿瘤异常蛋白监测系统图像分析仪(曼想科技公司提供)，通过显微装置观察TAP凝聚形态，并定量计算其覆盖面积。

1.3 HPV分型检测方法

于患者月经干净后≥3 d进行采样，取截石位，以鸭嘴型窥器充分暴露宫颈，棉拭子轻轻擦去过多分泌物，置入一次性宫颈采样刷，以宫颈外口为圆心，覆盖宫颈外口转化区及宫颈管内，施加适当压力沿固定方向刷取5～10周，装入细胞保存液彻底洗脱细胞，混匀后分装至2个样品管封存；其中1份样品采用cobas 4800系统(罗氏Roche公司提供)自动执行细胞裂解与DNA提取、纯化，采用LineGene 9660荧光定量PCR检测系统(博日BIOER公司提供)扩增HPV与内质控β-goblin基因的目标DNA序列，使其目标DNA序列能够与相应的荧光探针结合，不同亚型HPV DNA探针以不同荧光染料进行标记，通过实时监测样本的荧光信号确定其含有的HPV种类与载量，以循环阈值<40.0判定为对应亚型HPV阳性，高危型HPV涵盖16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14种亚型，其余6、11、30、42、43、44等亚型则为低危型，≥2种HPV亚型阳性可提示混合感染。

1.4 TCT方法

以上述采样获得的另1份样品管为标本，置入HQTCT-Thin Plus膜式全自动液基薄层细胞制片机(鸿琪HQ公司提供)，经由过滤、细胞富集、排液、吸附转移制备为液基薄层涂片并在95%乙醇中固定，多次冲洗后通过苏木素核染色、碱化、橙黄胞质染色后以中性树胶封固，由科内高年资医师在高倍镜下进行判读，参考Bethesda系统诊断标准(TBS)[8]，诊断结果分为：未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)、不典型鳞状上皮细胞(ASC)、LSIL、HSIL及鳞状细胞癌(SCC)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者外周血TAP水平及HPV分型检查结果比较

危险组外周血TAP水平明显高于对照组，而两组HPV分型检查各结果分布也存在明显差异，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者外周血TAP水平及HPV分型检查结果比较

2.2 两组患者TCT结果比较

危险组TCT结果病变程度明显较对照组更严重，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者TCT结果比较(例，%)

2.3 诊断效能分析

外周血TAP筛查诊断宫颈癌ROC曲线截断值为123.74 μm2，该指标联合以HPV分型检查、TCT筛查诊断宫颈癌ROC曲线AUC为0.892(95%CI=0.831～0.952)，明显大于各项单筛检查方案，差异均有统计学意义(P<0.05)，敏感性为86.96%，特异性为79.69%，见图1、表3。

图1 各检查方案筛查诊断宫颈癌的ROC曲线

3 讨论

目前临床推荐的治疗策略中，LSIL与慢性宫颈炎症多以随访观察、物理治疗等保守措施为主，病情具有可逆性，而HSIL恶变趋势几乎不可逆转，与宫颈癌类似，需及时采取手术治疗[9]，因此尽早通过筛查作出分级诊断对改善预后尤为关键。

既往临床宫颈细胞学检查多通过宫颈刮片进行采样，一方面刮取细胞可能不具有检测价值，部分细胞难以转移至载玻片，另一方面制片过程中也可能由于操作原因令细胞发生变形，暴露在空气中不易保存，处理不当时炎症细胞、血细胞及粘性分泌物也将干扰读片，存在较高漏诊率[10]。自TCT推广应用以来，采用宫颈细胞刷能采集面更广且更均匀，通过保存液及程序化制片技术，极大提高细胞转移效率与涂片质量，可将宫颈上皮内病变诊断灵敏度由38%提高至65%[11]。然而细胞学检查归根结底需在镜下判读，虽然诊断标准明确，但仍受到医师主观性的影响，可重复性欠佳，假阴性率仍较高。本研究中，危险组TCT结果病变程度显著较对照组更严重，其筛查诊断宫颈癌的敏感性与特异性分别为50.00%、93.75%，这表明部分宫颈病变患者无法通过细胞学特征进行准确诊断，究其原因可能与HPV感染早期引起宫颈细胞形态变化不明显有关。

高危型HPV感染宫颈移行带基底层细胞是宫颈癌病理进展的必须因素，病毒复制到一定数量可通过修饰遗传物质，上调表达E6、E7等蛋白，介导宫颈上皮细胞正常生命周期，破坏信号传递与免疫识别机制，从而诱发癌变[12]。HPV分型检测是以其遗传物质DNA为目标，通过PCR靶点优选、靶点扩增、自动化实时检测、选择性扩增的过程，识别相应HPV复制情况，其精度较第二代杂交捕获试验检测更为理想[13]，可便于临床医师精确判断HPV感染亚型，及时作出跟踪随诊，有效提高诊断效能。本研究发现，危险组HPV分型检查各结果分部比率与对照组差异较大，其敏感性与特异性分别为78.26%、68.75%，提示HPV分型检查尽管能有效识别感染，但由于特异性不足，可能导致部分患者因诊断高估病情而接受必要的阴道镜活检或过度治疗，因此部分学者不建议30岁以下女性开展[14]。

表3 ROC曲线相关参数

注：AUC与联合筛查比较，*为P<0.05。

肿瘤细胞发生恶变时，其内部诸如糖基转移酶、糖苷酶等糖基化修饰酶类活性降低，细胞表面糖蛋白结构发生变化，N-联聚糖分支增加，将TAP释放进入外周循环系统，细胞黏附性降低，因而更易发生浸润或转移[15]。据相关文献报道，外周血TAP检出阳性但其他检查项目均未发现肿瘤的患者在随访18个月后，发现有3.6%确诊恶性肿瘤，因此尤其适宜于卵巢癌、宫颈癌等发病率高且起病隐匿的妇科肿瘤筛查，该指标可起到良好的早期预警作用[16]。TAP不同于传统的血清肿瘤标志物，通常采集受检对象少量末梢血于载玻片上开展检测试验，观察其凝聚颗粒覆盖面积进行诊断，早期定性研究发现其阴性结果多表现为雪花状、树枝状或年轮状的条带聚集形态，颗粒之间存在网格状花纹，而阳性结果则多以边缘规整的类圆形、团块状聚集形态，周围附有少量黑色颗粒[17]，试验现象典型性强。本研究结果显示，危险组外周血TAP水平明显高于对照组，单筛宫颈癌截断值为123.74 μm2，与以往研究中的121 μm2较为接近，且联合HPV分型检查、TCT筛查诊断宫颈癌的敏感性与特异性分别为86.96%、79.69%，ROC曲线AUC显著增大，这说明外周血TAP能从细胞学、病毒学而外的角度窥探宫颈上皮细胞癌变情况，因此有较好的补充效果，有助于提高诊断效能，且该指标作为相较于血清肿瘤标志物更便于检测，能在基层医院推广普及。许刚等[18]在宫颈癌同步放化疗前后检测外周血TAP也获得相似结论，发现其水平与患者疗效及预后密切相关，治疗后TAP阳性率下降，而TAP阳性患者生存时间也显著较短。

综上所述，外周血TAP可对HPV、TCT宫颈癌筛查项目诊断信息作出补充，联合应用具有较高诊断效能，可避免误诊与漏诊，有较高临床应用价值。