系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ADAR1与IFN－α的相关性及临床意义

狄雪琪，高聪聪，张纯 ，孙文博，梁文芳，姚孟辉，王倩倩，郑朝晖

（郑州大学第一附属医院风湿免疫科，河南郑州 450052）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多因素自身免疫性疾病，其发病机制尚未明确。研究显示SLE患者的血液系统有异常高的RNA编辑水平，一些会影响蛋白质翻译并可能产生新的自身抗原［1］。RNA腺苷脱氨酶（adenosine deamina ses acting on RNA，ADAR）是能将RNA中腺苷转变为肌苷的A至I编辑酶。ADAR1是第一个被识别且表达最广泛，是哺乳动物中有编辑酶活性的脱氨酶之一。近期发现ADAR1基因突变与多种自身免疫性疾病有关，如Aicardi－Goutières综合征某些表型与 SLE相似，患者I型干扰素（IFN）升高，其严重的自身免疫表现强调了ADAR1在维持体内免疫平衡方面的重要性［2］。Vlachogiannis等［3］明确所有类风湿性关节炎患者滑膜组织及活动性患者血液中ADAR1升高，经治疗改善后ADAR1下降。研究者在HeLa和MCF7细胞体外实验发现，IFN－α水平改变可调节ADAR1表达，而在SLE患者中，血清I型IFN升高（主要是IFN－α）并参与发病［4］。鉴于尚无探讨 SLE中 IFN－α与ADAR1相关性的研究，本研究旨在明确 SLE患者PBMCs中ADAR1与血清IFN－α的相关性及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1—8月于郑州大学第一附属医院风湿免疫科住院治疗的30例SLE患者，均为汉族女性，符合1982年美国风湿病学会标准［5］对SLE的分类。排除标准：（1）合并其他自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎等；（2）合并病毒感染、肿瘤、器官移植；（3）怀孕或哺乳期。另外有30名健康女性（体检信息未显示明显异常）志愿参与这项研究（对照组）。收集患者及对照组的年龄、发病时间等人口统计学信息，及患者的血尿常规、抗体检测结果等实验室检查数据，评估其临床症状并计算SLE活动指数 （SLE disease activity index，SLEDAI）［6］。此研究方案已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审查编号2019－KY－187）。所有患者均提供书面知情同意书。

1.2 PBMCs提取收集SLE患者和对照组清晨空腹外周静脉血20 mL，置于 EDTA抗凝管中，采用Ficoll－Hypaque（Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden）密度梯度离心法分离 PBMCs，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤并经红细胞裂解液 （Solarbio，Beijing，China）裂解红细胞后，置于－80℃冷冻保存用于后续实验。

1.3 RNA提取和qRT－PCR实验采用 TRIzol（Servicebio，Wuhan，China）法提取 PBMCs的总 RNA后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用 NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Shanghai，China）检测 OD260nm／OD280nm的比值，对大于1 8～2 0的样品用 RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Shanghai，China）反转录为cDNA。另外，通过定量逆转录－聚合酶链反应（quantitative reverse transcriptase polymerase chain re action，qRT－PCR）来测量靶基因mRNA的相对水平。ADAR1的引物序列为 5’－TGTGGGTGGCCTTTTG GAGT－3’（正 向）和 5’ －ACCAGCGAC CCCCAACTTTT－3’（反 向）（Servicebio，Wuhan，China）。所有实验均重复3次。扩增人ACTIN cDNA作为内参对照。

1.4 血清IFN－α水平检测收集SLE患者和对照组清晨空腹外周静脉血5 mL，置于干燥的红头普通采血管中，低速离心获得血清后，按照制造商的说明，使用人IFN－α试剂盒（CUSABIO，Wuhan，China）通过酶联免疫吸附测定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清 IFN－α水平。检测范围为12 5～800 0 pg·mL－1。

1.5 统计分析采用 SPSS 21 0（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）统计软件，进行正态性检验，符合正态分布的数据用均值±标准差（Standard Deviation，SD）表示，不符合正态分布的用中位数和四分位数表示，组间比较采用 Mann－Whitney U检验，采用Spearman相关性分析。P＜0 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料描述30例SLE患者均为女性，年龄为20～55岁，平均（32 93±4 97）岁，病程分布为30 00（2 00，99 00）个月，其中非活动期 6例，中度活动期12例，重度活动期12例，肾脏受累13例，24 h尿总蛋白（24 h UTP）为2 45（0 24，7 40）g，血液系统受累13例，关节受累12例。对照组年龄为24～52岁，平均（30 52±3 15）岁，其性别、年龄、种族与 SLE组比较，差异无统计学意义（均P＞0 05）。

2.2 血清IFN－α和PBMCs中ADAR1的表达量及两者相关性分析SLE组PBMCs中ADAR1表达量［0 73（0 27，1 54）］高于对照组［0 44（0 25，0 69）］（P＜0 05）（图1A），SLE组血清 IFN－α水平［82 06（46 44，177 63）pg· mL－1］高 于 对 照 组 ［0 00（0 00，4 62）pg·mL－1］（P＜0 01）（图 1B）。分析发现在30例SLE患者中有25例IFN－α水平＜260 0 pg·mL－1，当血清 IFN－α水平 ＜260 0 pg·mL－1时，PBMCs中ADAR1的表达水平与血清IFN－α水平呈正相关（P＝0 046，r＝0 402，n＝25）（图1C）。

图1 血清IFN－α和PBMCs中ADAR1的表达量及两者的相关性分析

2.3 SLE患者血清IFN－α和PBMCs中ADAR1表达水平与疾病活动度的相关性分析SLE组PBMCs中ADAR1表达水平与SLEDAI和24 h UTP呈正相关，而与C3和C4无相关性。SLE组血清IFN－α水平与SLEDAI呈正相关，与C3呈负相关，而与C4和24 h UTP无相关性。见表1。

表1 SLE组血清IFN－α和PBMCs中ADAR1表达水平与临床指标的相关性分析

3 讨论

Laxminarayana等［7］提出SLE中较高的ADAR1水平可增加T细胞中的病理性RNA编辑，A至I RNA编辑是SLE中诱发基因突变的新机制。这是一种遗传信息修饰机制，是基因调控在转录后水平发生的另一重要事件，可催化转录初产物 RNA前体（pre－RNA）中特定部位的腺苷转变成肌苷，从而产生新的遗传密码，是蛋白质分子多样性发生的重要机制之一［8］。SLE患者整体编辑活动升高是炎症状态的一种表现，导致编辑的蛋白质种类增多、水平升高［9］。它们有可能被加工成自身抗原表位，之后可能被呈递至主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子上，从而刺激自身免疫反应［1］，进而可能加重SLE患者的病情，临床上可表现为靶器官受损加重、SLEDAI评分增高等。本研究发现SLE组PBMCs中ADAR1表达水平高于对照组，这与Laxminarayana等［7］的研究结果一致。此外，实验中发现 SLE组PBMCs中ADAR1表达水平与SLEDAI呈正相关。因此，随着将来继续扩大样本量与完善实验，检测SLE患者PBMCs中ADAR1表达水平或可能和经典的抗dsDNA抗体发挥相似作用，成为一个评估SLE疾病活动度的潜在生物标志物。

SLE患者血清有较高水平的IFN－α，并在体内引起多种免疫反应。B细胞、T细胞和粒细胞等细胞内具有较高的I型IFN诱导基因［10］。IFN－α可通过调节各种免疫细胞的分化、激活和功能来影响免疫系统，从而促进SLE的发病［11］。本研究显示 SLE组血清IFN－α水平高于对照组，且与SLEDAI呈正相关，与C3呈负相关，这些发现与Oke等［4］的研究结果一致。Fritzell等［12］分别在Hela和MCF7两种体外细胞系中由低到高加入不同浓度的 IFN－α，最高浓度达200 U·mL－1，结果显示，随着加入IFN－α浓度的升高，两种细胞系均显示A至I的编辑率升高，ADAR1的表达量升高，说明在此浓度内的IFN－α可以最大程度的诱导编辑，而超过200 U·mL－1的IFN－α并不能继续诱导升高ADAR1的表达。我们的实验证实SLE组 PBMCs中ADAR1的表达与一定范围内血清IFN－α水平呈正相关。可能存在两种原因：第一，在此范围内的血清IFN－α可以最大程度地诱导编辑，以浓度依赖性增加ADAR1的表达，但Fritzell等［12］并未在其研究中明确这种诱导升高的机制；第二，ADAR1已被证实是IFN反应（包括IFN产生和IFN信号传导）的关键抑制因子，它保护细胞免受过度激活的IFN信号传导产生的有害影响［13］，在SLE患者中有较高水平的IFN－α和IFN信号传导，ADAR1作为IFN反应的抑制因子，或可能是为抑制高水平的IFN相关反应而反馈性增加，进而可在一定程度内控制高水平的IFN－α，引起SLE患者病情加重。此外，研究发现血清IFN－α为260 pg·mL－1是一个分界点，当IFN－α超过此浓度时ADAR1表达水平开始呈下降趋势，但在本实验中仅有5例患者IFN－α浓度高于260 pg·mL－1，无法行严谨的相关性分析。Li等［14］在HEK293T细胞体外实验中证实高浓度的IFN－α可以剂量依赖性诱导ADAR1表达量下降，并认为IFN－α是通过促进 ADAR1泛素化导致其降解。因此，ADAR1在SLE患者中是否存在这种降解机制值得进一步研究。

本研究明确了ADAR1和血清IFN－α在SLE患者中的异常表达，并分析其与临床指标的相关性，发现SLE患者PBMCs中ADAR1表达水平与血清IFN－α的相关性，提出ADAR1或可成为一个评估SLE疾病活动度的潜在生物标志物，且SLE患者中异常表达的IFN－α可能参与调节PBMCs中ADAR1的表达。这些发现为进一步探索SLE发病机制提供了新线索，并为靶向药物的研发提供理论基础。