正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L对老年2型糖尿病免疫炎症的调节作用

林媛媛 黄雪梅 邹欣婷 韦海涛 张海燕

(1南宁市第一人民医院内分泌科，广西 南宁 530021；2云南省第一人民医院)

2型糖尿病是一种较为常见的慢性、终身性疾病，发病率较高，发病率随年龄的增加而增加，在世界范围内，我国糖尿病位于第二位，仅次于印度〔1,2〕。在以往关于老年2型糖尿病的临床研究中，中心环节为胰岛素抵抗、胰腺β细胞功能下降、遗传等，近年来临床研究发现2型糖尿病也属于一种免疫相关性炎症疾病，在2型糖尿病发生、发展的整个过程中，异常的机体免疫调节发挥着重要作用〔3,4〕。大量临床研究表明，2型糖尿病与免疫调节紊乱紧密关联，且多认为2型糖尿病与B细胞增殖分化、功能异常等有关，而B细胞免疫应答与T细胞密不可分，其中B细胞抗体主要由CD4+T细胞产生〔5,6〕。ICOS/ICOSL、OX40/OX40是T细胞、B细胞活化的主要协同刺激信号，在机体免疫应答反应中有重要的调节作用〔7〕。以往关于老年2型糖尿病免疫炎症的研究多集中于OX40/OX40的研究，关于ICOS/ICOS的研究涉及较少。本研究旨在探讨正性其刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40对老年2型糖尿病免疫炎症的调节作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1病例资料 南宁市第一医院2017年1月至2018年1月收治的老年2型糖尿病患者中随机选取40例，设为研究组，纳入与排除标准如下：①纳入经美国糖尿病协会制定的标准确诊为2型糖尿病者；②纳入无严重并发症者；③排除合并其机体器官疾病者；④排除合并其他血液系统、免疫系统、精神疾病者。其中男23例，女17例；年龄61～78岁，平均(71.52±6.87)岁；病程1～10年，平均(5.51±3.42)年。另随机选取同期于本院接受体检的健康人员40例，男22例，女18例；年龄62～76岁，平均(69.51±6.88)岁。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。两组均签署知情同意书，且医院医学伦理会已批准此研究。

1.2仪器与试剂 流式细胞分析仪、离心机均购自Beckman Coulter，流式抗体、乙二胺四乙酸、红细胞裂解液、磷酸缓冲盐溶液均购自BD公司。

1.3检测方法 两组受检者处于空腹状态下时，采集的外周血液标本2.0 ml，通过乙二胺四乙酸展开抗凝处理，将抗凝处理后的血液标本于两支EP管中加入，各0.05 ml，按1∶100的比例将相关流式抗体加入：第一管中分别将CD4-FITC、抗人ICOE-PE、抗人OX40-PERCP、抗人CD40L-APC抗体加入，第二管中分别将抗人CD19-FITC、抗人ICOSL-PE、抗人OX40L-PERCP、抗人CD40-APC、抗人OX40-FITC抗体加入，避光，进行0.5 h的孵育，展开离心处理，5 000 r/min，共2 min，将上清去除，加入1.0 ml磷酸盐缓冲液进行洗涤，将红细胞裂解液加入，避光进行10 min的孵育，再次行离心处理，5 000 r/min×2 min，去除上清，通过磷酸盐缓冲液进行洗涤，再次加入磷酸盐缓冲液展开重悬处理，通过流式细胞分析仪进行检测。

1.4观察指标 ①两组B细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达情况。②两组CD4+T细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达情况。③研究组存在大血管病变与无大血管病变患者ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达情况。④研究组ICOS/ICOSL与dsDNA抗体、IgG抗体的相关性，研究组OX40/OX40与抗核抗体水平的相关性。

1.5统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验，χ2检验。

2 结 果

2.1两组B、CD4+T细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达 研究组B、CD4+T细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组B、CD4+T细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达对比

2.2研究组合并大血管病变与未合并者ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达对比 合并大血管病变的患者B细胞、CD4+T细胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达均显著高于未合并大血管病变者(P<0.05)，见表2。

病情nB细胞ICOS/ICOSLOX40/OX40LCD4+T细胞ICOS/ICOSLOX40/OX40L未合并大血病变231.96±0.3210.82±2.110.97±0.140.86±0.12合并大血管病变172.69±0.2716.78±1.011.65±0.331.31±0.20t/P值7.609/0.04010.746/0.0318.889/0.03818.718/0.029

2.3研究组ICOS/ICOSL、OX40/XO40L表达与抗体相关性 研究组ICOS/ICOSL与dsDNA抗体(r=0.817，P<0.05)、IgG抗体呈正相关(r=0.863，P<0.05)；研究组OX40/OX40L与抗核抗体水平呈正相关(r=0.971，P<0.05)，见图1。

图1 ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表达与抗体相关性

3 讨 论

2型糖尿病是其中常见的一种类型，占90.0%～95.0%〔8〕。2型糖尿病即非胰岛素依赖型糖尿病，发生主要受遗传、环境等因素影响，近年来大量临床研究表明2型糖尿病的发生与炎症、免疫遗传异常有关〔9，10〕。相关临床研究对老年2型糖尿病患者进行研究时，可见其促炎细胞因子、急性时相蛋白等水平上升，表明老年2型糖尿病的发生、发展受炎症因子影响。2型糖尿病患者有T细胞、巨噬细胞活化存在，会致使胰岛炎症放大，而T淋巴细胞属于机体主要免疫细胞群〔11〕。相关临床研究表明，老年2型糖尿病患者的CD3+、CD4+细胞水平均下降，且CD4+/CD8+失衡，进一步证实了2型糖尿病与细胞免疫功能的联系〔12〕。另有研究者发现2型糖尿病患者Th1/Th2失衡，Treg水平下降，表明2型糖尿病T细胞亚群存在异常，具有免疫调节作用的细胞数量、功能均有异常〔13〕。同时，2型糖尿病患者也存在炎症反应，主要表现为由B细胞进行分泌的IL-8(促炎细胞因子)水平上升，IL-10(抗炎细胞因子)水平下降，表明在2型糖尿病中B细胞功能失调也有参与。

人ICSO基因处于染色体2g33上，CD28-CT-LA-ICOS与多个自身免疫性疾病相关，如2型糖尿病、红斑狼疮等〔14〕。ICOS可对活化的T细胞凋亡产生抑制作用。此外，对T细胞进行体外培养并将ICOS加入后，可见炎症因子水平上升，且上升量为CD28共刺激时的30.0%～90.0%〔15，16〕。本研究结果表明2型糖尿病患者ICOS/ICOSL正向协同刺激通路存在明显的活化。本研究结果还表明2型糖尿病患者ICOS/ICOSL升高可能会使CD4+T细胞与T细胞的相互作用增强，导致自身抗体、免疫应答过度产生，进而对组织造成损伤。

在多种自身免疫性疾病中，OX40/OX40L信号通路均有参与，抗OX40L单克隆抗体可对自身反应性T细胞产生选择性地剔除作用，使自身免疫性疾病患者病情得以缓解〔17〕。OX40L主要于活化的B细胞、巨噬细胞等中表达，抗原提呈表面的OX40L会与T淋巴细胞表面OX40进行结合，提供T细胞活化的信号通路，进而使T淋巴细胞活化，并迁移至炎症病灶处。此外，OX40/OX40L信号通路可对树突细胞的分化成熟产生促进作用，而树突细胞活化后可对T细胞进行激活，使血管内皮细胞受到损伤，并促使炎性细胞因子产生，加剧免疫炎症反应〔18〕。本研究结果提示在2型糖尿病的致病过程中，OX40/OX40L有所参与。此外，本研究结果提示在自身抗体中OX40/OX40L有重要作用。OX40L会与B细胞、树突细胞等表明的CD40产生配基化反应，使三聚体形成，并结合相关受体因子，达成信号转导，使免疫效应细胞活化，进而促进大量共刺激分子表达，对机体特异性免疫应答反应进行诱导与调节。B细胞属于不成熟状态的抗原提呈细胞，静止时对共刺激分子的表达极低，OX40与OX40L产生相互作用时，可促进B细胞活动，促进B淋巴细胞分泌促炎因子。

2型糖尿病患者在病程发展过程中，机体处于高血糖环境下，细胞炎性反应会增加，进而导致患者出现并发症，如大血管病变〔19〕。ICOS在2型糖尿病患者B细胞、CD4+细胞上的表达与疾病活动程度有关，ICOS水平随病程的延长而增加，2型糖尿病患者出现大血管病变后，病情加重，免疫功能异常程度提升、炎症反应增强，ICOS/ICOSL表达水平随之上升，而ICOS/ICOSL表达水平上升又会进一步加重机体病理性损伤〔20〕。因此，临床上对2型糖尿病患者实施诊治时，可将ICOS/ICOSL表达水平作为一个指标，以对疾病活动度、大血管病变出现的风险进行评估，而采用生物学方法对ICOS/ICOSL的共刺激通路进行阻断有望成为2型糖尿病的一个治疗靶点。OX40/OX40L可为T细胞提供活化的共刺激信号，使T细胞大量增殖，并产生相关细胞因子。同时OX40/OX40L可对Th2这一T辅助细胞因子、IL-17的表达进行调节，对B细胞分化产生作用，进而参与至自身免疫调节中〔21〕。2型糖尿病患者机体在高血糖状态影响下，会有大量的OX40L产生，并参与血管内皮的炎性反应。膜型OX40L可与T细胞表达的OX40受体直接结合，促进T细胞活化。不仅如此，OX40L还能够存在可溶性形式，sOX40L与T细胞表面的OX受体结合后，可从血液循环中通过，并与远端的T细胞表面受体结合，对淋巴细胞产生诱导作用，使其功能活化，使炎性反应加快，并放大已有炎性反应，进而使患者出现大血管病变。可见，在2型糖尿病出现大血管病变的过程中，OX40/OX40L共刺激信号有重要作用，而大血管病变是2型糖尿病患者常见且严重的一种并发症，也是2型糖尿病患者死亡的主要原因，将OX40L当作靶点对2型糖尿病患者进行干预，可为其大血管病变的防治提供新的思路。