辽宁地区稻谷粮堆真菌分布及演替规律的研究

王鹏杰 祁智慧 张海洋 田 琳 杨洪志 马鹏飞 高瑀珑 唐 芳

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心， 江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室1，南京 210023) (国家粮食和物资储备局科学研究院，粮食储运国家工程实验室2，北京 100037) (中央储备粮抚顺直属库有限公司3，抚顺 113004)

稻谷作为我国三大粮种之一，是我国重要的储备粮种。稻谷储藏期间，霉变是造成粮食损失的一个重要因素[1,2]。稻谷储藏过程中，当储藏条件适合真菌生长时，这些真菌就会分解和利用稻谷中的营养组分、破坏其质构，使其品质发生不同程度的劣变[3,4]，若不及时采取相应的控制措施就会导致粮堆发热霉变。稻谷粮堆是一个复杂的生态环境，由于储藏条件的限制，不同粮堆位置稻谷真菌生长及演替规律会存在差异，增加了稻谷的保质保鲜、储存及仓储管理的难度，因此研究稻谷粮堆不同位置霉菌生长演替规律及品质变化具有重要的现实意义。

为了探究稻谷储藏过程中真菌的生长及其品质变化，国内外开展了一些相关研究工作。Christensen[5]将谷物携带真菌分为两大类：田间真菌和储藏真菌，并对储藏稻谷的霉变进行了研究，结果表明储藏期间生长的真菌主要为曲霉，尤其是灰绿曲霉属，曲霉的生长会降低稻谷种子的萌发率并影响其食用品质风味等[6]。Magan等[7]研究确定了储粮真菌的最低生长含水量及最适生长温度，结果表明在不同温度与湿度条件下，田间真菌和储藏真菌之间存在竞争演替规律。唐芳等[8]研究了稻谷在30 ℃下不同含水量对储藏真菌生长的影响，结果表明优势危害真菌在灰绿曲霉和白曲霉，16%左右的储粮含水量是这两种曲霉优势生长的转折点，含水量高于16%后灰绿曲霉生长由强变弱，白曲霉生长由弱变强。周建新等[9]通过模拟储藏，发现稻谷储藏温度越高、含水量越高，稻谷霉菌量增长越快，且曲霉是优势菌；霉菌量低于104CFU/g时，稻谷处于安全储存状态。Genkawa等[10]研究了不同含水量的稻谷在储藏过程中真菌生长情况、发芽率及脂肪酸值的变化，结果表明低含水量稻谷基本无真菌生长，发芽率在90%以上，脂肪酸值变化不大。由上述研究可知，储藏温度和含水量对稻谷储藏过程中霉菌种类及生长有重要的影响。

上述研究结果多基于模拟储藏实验，储藏条件相对稳定单一，而实际仓储环境相对复杂，特别是我国粮食储备体系，储备仓型80%为高大平房仓，单仓体积均在千吨以上，大粮堆储藏环境复杂多样，而目前针对稻谷实仓大粮堆中不同空间位置的储藏状况的研究鲜有报道。本研究基于辽宁省抚顺直属库，选择我国普遍使用的高大平房仓，对粮堆中不同空间位置储藏一年稻谷的霉菌区系分布、演替规律及其品质进行研究，旨在探明高大平房仓中不同空间位置对稻谷储藏的影响，为我国东北地区稻谷优储提供参考。

1 实验材料及设备

1.1 实验仓基本条件

本研究选用中央储备粮辽宁省抚顺直属库高大平房仓7号仓为实验仓。粮堆体积的长、宽、高分别为59、23、6 m，仓容6 400 t，仓房配备有粮情检测系统、机械通风和空调控温等设施。所储稻谷为当地2017年收获的粳稻，2017年12月入库，散粮储藏。实验仓采用空调控温方式，2018年6月份启动，仓温超过22 ℃时自动启动空调降温。

1.2 实验试剂

高盐察氏琼脂、察氏琼脂、氯霉素、无水乙醇、氢氧化钾。

1.3 主要仪器与设备

粮情监测系统；Panasonic MLS-3781L高压蒸汽灭菌锅；BMJ-250C霉菌培养箱；KS-2康氏振荡器；HERAsafeKS12生物安全柜；DJSFM-1粮食水分测试磨；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱。

2 实验方法

2.1 稻谷粮堆检温电缆布点方法

本研究选用中央储备粮辽宁省抚顺直属库高大平房7号仓储藏一年的粮堆稻谷为研究对象，粮堆内共设置72个检温点，其中南北方向每组6个，两点间隔4.4 m，两端距墙0.5 m；东西方向每组12个，两点间隔5 m，两端距墙2 m；每点设置4层，粮堆检测温度布点层数及分布情况见图1。

2.2 稻谷样品采集方法

辽宁抚顺直属库高大平房7号仓稻谷储存一年后，基于粮情检测系统温度传感器布点位置，选择仓房的东南、东北、西南、西北四个角(1、6、67、72)和中心点(33)五个位点，分三层取样，取样深度与检温电缆分别在1、2、4层的位置重合，分别定义为上层、中层、下层，见图1。辽宁抚顺直属库高大平房7号仓全仓五点三层共15个取样点，每点取样200 g，采样于无菌密封袋，并置于4 ℃冰箱低温保存。

2.3 粮堆稻谷温度检测方法

粮堆稻谷温度检测方法，参考粮库中测温电缆检测数据。

2.4 粮堆稻谷水分测定方法

粮堆稻谷水分检测方法，参考GB/T 5497—85粮食、油料检验水分测定法105 ℃烘干法[11]。

2.5 粮堆稻谷菌落总数检测方法

粮堆稻谷菌落总数检测方法，参考GB/T4789.15—2003食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母计数[12]。

2.6 粮堆稻谷霉菌分离纯化鉴定方法

根据平板培养的结果，挑选平板中分布较多的菌株，标记，采用平板划线分离法、三点法在察氏培养基上反复进行霉菌的分离纯化，得到纯化菌株。然后采用形态特征[13,14]与分子生物学技术[15]相结合进行菌种鉴定。

图1 粮堆粮情检测系统温度传感器分布及取样分布图

2.7 粮堆稻谷发芽率的测定

参考GB/T 5520—2011粮油检验籽粒发芽实验[16]方法，发芽率用4组试样结果的平均值来表示。

2.8 粮堆稻谷脂肪酸值的测定

粮堆稻谷脂肪酸值的测定参考GB/T 15684—2015谷物研磨制品脂肪酸值的测定[17]方法。

2.9 数据处理和分析方法

实验数据处理通过SPSS软件(version 22.0，SPSS Inc.)，实验结果以(x±SD来表示，数据间的多重比较采用Duncan新复极差法(SSR)，P<0.05表示差异显著。粮情布点分布图由Microsoft Visio软件处理获得。

3 结果与讨论

3.1 稻谷粮堆度夏期间温度变化情况

依据2.2中样品采集方法，提取辽宁抚顺直属库高大平房7号仓稻谷对应五点三层的粮温数据，五点三层8—9月单点平均温度分布情况见图2。

图2 粮堆各采样点8—9月平均粮温情况

由图2可知，8—9月，在仓内空调控温低于22 ℃的情况下，粮堆上层(距离粮堆表面0.5 m处)五个点的温度均能达到20 ℃左右；粮堆中层(距离粮堆表面2.2 m处)5个点的温度差异较大，因粮仓的四角温度受外界环境热辐射影响，所以明显高于中心点温度(P<0.05)，特别是西南角(67号点)8月平均温度达到24 ℃，而33号中心点温度保持在5 ℃以下，下层温度也有类似中层温度的规律。由此可见，仓房墙壁的保温隔热效果对四壁边缘稻谷温度影响非常大，至少可影响到距离墙壁2 m位置，是大粮堆出现冷心热皮的原因之一。以粮堆采样点作变异源，对粮温作方差分析。因素“粮堆采样点”F=71.4，由于实得F > F0.01(14，120)=2.4，表明粮堆各采样点粮温差异极显著，说明粮堆采样位置对粮堆温度有显著影响。

从粮堆5月至10月整个度夏期间粮温变化情况分析，粮堆的上层温度均高于中层和下层，7月中旬前粮堆下层温度高于中层，7月中旬后中层温度高于下层。北方高大平房仓冬季时通常要进行通风均温，使整仓平均温度降至-10～-5 ℃，此时粮堆温度上层<中层<下层。春季随着外界环境温度的逐步升高，上层稻谷粮温受仓温影响升温速度较快，所以上层温度变为最高。由于稻谷粮粒导热性较差[18]和冬季蓄冷作用，中层温度一直处于较低水平，仍低于粮堆下层温度。进入夏季后，上层粮堆热量缓慢向下传导，使得中层(2.2 m)粮温逐渐升高，因此7月中旬之后粮堆中层温度逐渐高于下层，即仓温的热量经过长时间的传导作用，至少可影响到粮面以下2 m位置。本研究的粮堆不同深度温度变化规律与李志民等[19]报道的高大平房仓粮堆温度变化规律基本一致。

3.2 粮堆各采样点稻谷含水量分布情况

按照2.3方法测定辽宁抚顺直属库高大平房7号仓初入库稻谷含水量及储存一年后各采样点稻谷样品含水量。初入库稻谷经过通风处理后，含水量基本均衡在14.5%。储藏一年后粮堆五点三层每个位点的平均含水量分布规律基本为上层>中层>下层。从平面位置分析，中心点33号点含水量最高，粮仓靠近东面墙的两点(1点、6点)含水量居中，靠近西面墙两点(67点、72点)最低。以粮堆采样点作变异源，对粮堆含水量作方差分析。因素“粮堆采样点”F=362.0，由于实得F>F0.01(14，15)=3.7，表明粮堆各采样点含水量差异极显著，说明粮堆不同采样位置对稻谷含水量有显著影响。如3.1所指，北方粮仓冬季会选择合适时机进行压入式通风以达到粮仓均温的目的，通风过程中会带走粮食的部分水分，特别是粮堆下层由于持续受上行空气的影响，最终导致下层粮食含水量较低[20]。同时，由于受夕晒影响，粮仓西面墙夏季温度最高，粮堆存在霉变风险，靠近西面墙位置稻谷含水量通常要低于整仓稻谷的平均含水量，这可以在稻谷入仓时通过控制其含水量，或通过优化风道布置加强通风，以降低西面墙附近粮食含水量，以确保稻谷储藏安全。

3.3 稻谷粮堆真菌分布及演替规律

3.3.1 粮堆不同深度真菌分布及演替规律

按照2.5和2.6方法，对辽宁抚顺直属库高大平房7号仓初入库稻谷样品及储存一年后五点三层的稻谷样品进行了真菌分离、纯化与鉴定，并记录不同真菌的数量。本研究共分离出15种真菌，其中4种真菌数量极少，总数占比不到1%，对稻谷储藏影响较小，其余11种真菌，单个种类占比均大于3%，作为后续分析的重点。样品分离的主要优势菌有层出镰刀镰孢霉(Fusariumproliferatum)、链格孢霉(Alternariaalternara)、芽枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)、灰绿曲霉(Aspergullusglaucus)和多育曲霉(Aspergullusproliferans)，对优势菌按照文献[21]进行分类，层出镰刀镰孢霉和链格孢霉为田间真菌，芽枝状枝孢霉为过渡真菌，灰绿曲霉和多育曲霉为储藏真菌，此分类结果为后续真菌演替规律分析提供依据。

3.3.1.1 初入库粮堆真菌分布

初入库稻谷样品经平板菌落分离纯化培养后，真菌总量为5.3×103CFU/g，其中田间真菌链格孢霉占比40.2%，过渡真菌芽枝状枝孢霉占57.9%。此时稻谷携带的主要是田间真菌和过渡真菌，未检出储藏真菌。

3.3.1.2 储藏一年粮堆上层真菌分布

对稻谷粮堆上层各点样品中分离出的主要真菌种类及比例分布情况进行了分析，结果见图3。

图3 稻谷粮堆上层真菌种类分布及比例情况

由图3可知，上层五点除33号点外，优势菌均为田间真菌，主要为层出镰刀镰孢霉，而33号点优势菌为储藏真菌，占比高达83.0%，主要为灰绿曲霉。结合各点温度和含水量分析优势菌的差异。粮食收获期间主要携带田间真菌，进入仓储环节后，所携带的田间真菌会随着仓储条件和粮食含水量的变化而变化。上层五点夏季平均粮温均在20 ℃左右，33号点含水量最高15.5%，灰绿曲霉所占比例最多，此点满足储藏真菌的生长条件，而一旦储藏真菌生长，就会破坏原有田间真菌的平衡，导致田间真菌数量和比例降低。其余各点含水量在14.2%～14.9%之间，除72号点(含水量14.2%)未检测出灰绿曲霉，其它四点均检出，且含水量越高，灰绿曲霉比例越高，原始携带的田间真菌比例越低，含水量是灰绿曲霉孢子萌发生长的一个诱因。

稻谷储藏过程中，生长和收获期间携带的田间真菌，在未受到其他菌属竞争生长抑制的情况下，会以孢子形式处于休眠状态以保留活性。当粮食含水量或温度升高，一旦储藏真菌生长，会破坏原有的微生物种群平衡，田间真菌数量和比例会降低。

3.3.1.3 储藏一年粮堆中层真菌分布

对稻谷粮堆中层各点样品中分离出的主要真菌种类及比例分布情况进行了分析，结果见图4。

图4 稻谷粮堆中层真菌种类分布及比例情况

由图4可知，粮堆中层五个点优势菌基本为田间真菌，主要为层出镰刀镰孢霉和链格孢霉，占比在49.7% ～ 75.6%。各点均不同程度检出过渡真菌，33号点过渡真菌的芽枝状枝孢霉占比达50.3%。西南角的67号点检测出一定比例灰绿曲霉生长，该点在8月份持续24.5 ～ 27.5 ℃的高温，平均温度达26 ℃，夏季持续高温是粮堆稻谷中灰绿曲霉孢子萌发生长的诱因，不过数量处于8×102CFU/g的数量级，不会对粮食造成危害。由此可见，温度是诱发储藏真菌孢子萌发的另一重要因素。

3.3.1.4 储藏一年粮堆下层真菌分布

本研究对稻谷粮堆下层各点样品中分离出的主要真菌种类及比例分布情况进行了分析，结果见图5所示。

图5 稻谷粮仓粮堆稻谷下层不同真菌种类及比例情况

由图5可知，粮堆下层五个点优势菌均为田间真菌，除6号点外，各点田间真菌占比基本在80%以上。粮堆下层在度夏期间，除西面墙附近温度达到10 ℃以上，其它位点平均温度均在10 ℃以下，中心点位置的平均温度甚至低于5 ℃。粮堆下层总体处于低温、低含水量状况，储藏条件较好，储藏真菌生长极少，对下层储藏微环境破坏小，有利于田间真菌孢子活性的保存[22]，这是该层有较高比例的田间真菌的主要原因。

3.3.1.5 储藏一年粮堆不同深度真菌分布及演替规律

将稻谷粮堆上、中、下三层，每层5点稻谷样品分离的真菌进行合并，并以层为单位分析真菌类群及比例关系，结果见图6。

图6 稻谷粮堆的上层、中层和下层三层不同真菌种类及比例情况

由图6可看出，稻谷粮堆储藏真菌比例分布规律为上层>中层>下层，而田间真菌分布规律为下层>中层>上层，过渡真菌比例分布规律是中层>下层>上层。北方地区粮堆不同深度的储藏环境条件对稻谷真菌分布及演替规律有重要影响。粮堆上层温度高，含水量相对偏高，储藏真菌生长成为优势菌，替代了部分田间真菌；粮堆中层、下层温度和含水量相对低，不适合储藏真菌生长，而适合田间真菌孢子保持活性，因而田间真菌为优势菌。

综上所述，粮食储藏过程中，粮食原有携带的田间真菌若演替为储藏真菌，表明粮堆环境可能出现过高温或高含水量的情况，优势菌的演替在一定程度上返过来可以表征粮堆微环境的变化。

3.3.2 粮仓粮堆稻谷不同位点真菌总数分布情况

对稻谷粮堆不同位点分离出的真菌种类及数量进行了分析，结合稻谷粮堆不同位点的温度和含水量条件，研究稻谷储藏过程中的真菌分布情况，结果见图7。

图7 稻谷粮堆各位点真菌总数分布

由图7可知，各位点真菌数量均在103CFU/g数量级以内，处于正常带菌量水平，但各点之间真菌总数存在差异。以粮堆采样点作变异源，对粮堆稻谷带菌量作方差分析。因素“粮堆采样点”F=30.2，由于实得F> F0.01(14，30)=2.7，表明粮堆各采样点真菌量差异极显著，说明粮堆采样位置对稻谷带菌量有显著影响。33号中心点稻谷真菌量相对较高，中层真菌总量达到6.0×103CFU/g，该点含水量为14.7%，度夏时，该点平均温度低于5 ℃，优势菌为田间真菌和过渡真菌，没有储藏真菌的生长，高含水量和低温环境是田间真菌和过渡真菌孢子保持活性的重要原因，而对于田间真菌和过渡真菌，粮食含水量低于18% ～ 20%时孢子不会萌发生长，不会对稻谷造成严重危害[21]，33号点上层由于储藏真菌的生长，破坏了田间真菌保存活性的环境，原携带的田间真菌数量大幅降低，因此上层真菌总数大幅降低，有80%为储藏真菌。西北角72号点和西南角67号点稻谷真菌量相对较少，结合这两点的含水量、温度和真菌种类综合分析可知，一方面由于低含水量、高温不利于田间真菌保持孢子活性，另一方面通过降低高温区域粮食含水量可有效抑制储藏真菌生长，降低了储粮风险。从真菌总数分析，由于北方地区高温季节相对较短，并且采用空调控温，稻谷在储藏过程中虽有储藏真菌生长，但其总数处于103CFU/g数量级以内，不会对粮食造成危害。

3.4 稻谷粮堆各位点储藏品质的变化

3.4.1 初入库稻谷品质

发芽率和脂肪酸值是研究稻谷储藏品质的两个重要指标[17,23]。稻谷发芽率易受储藏温度、稻谷水分和微生物生长的影响[24]。发芽率越高，稻谷储藏品质越好。稻谷的脂肪酸值受其品种影响较小，脂肪酸值是稻谷储存品质判定的重要指标之一[25]。稻谷在储藏过程中，脂肪酸值会发生变化，因为稻谷中的三酰甘油酯和磷脂中的脂肪酸在脂肪酶和磷脂酶的作用下释放出来[26]。在本研究中，初入库稻谷样品发芽率为98%，脂肪酸值为13.4 mgKOH/100 g，处于较低水平。

3.4.2 储藏一年后粮堆不同深度对发芽率的影响

本研究以稻谷的发芽率来分析粮仓各个位点对储藏一年后稻谷储藏品质的影响。粮堆不同位点稻谷储藏一年后的发芽率结果见图8。

图8 粮堆各位点脂肪酸值情况

由图8可知，实验仓中稻谷储藏一年后品质保持较好，发芽率基本在90%以上(P<0.05)，与初入库时相比降低幅度较小。5个位点不同深度的稻谷发芽率均呈现同一趋势，即上层<中层<下层，结合各位点不同深度的温度和含水量条件，夏季稻谷粮堆平均温度上层>中层>下层，粮堆含水量上层>中层>下层，粮仓稻谷的发芽率与温度和含水量均呈负相关，温度和含水量越高，发芽率越低。稻谷真菌检出量不高，每个位点稻谷带菌量均处于103CFU/g数量级，基本不会影响发芽率。

3.4.3 储藏一年后稻谷粮堆不同深度对脂肪酸值的影响

本研究粮堆不同位点稻谷储藏一年后的脂肪酸值结果见图9。

图9 粮堆各位点脂肪酸值情况

由图9可知，实验仓中稻谷储藏一年后除几个高温点外，其余位点的脂肪酸值均低于25 mgKOH/100 g(P<0.05)，与初入库时相比上升幅度较小，储存品质保持较好。五个位点不同深度的稻谷脂肪酸值基本呈现同一趋势，即上层>中层>下层，稻谷脂肪酸值会随着储藏温度的升高而逐渐增高[27,28,29]。72号点和67号点靠近粮库西面墙，在度夏期间，其受夕晒影响，温度较高，因此脂肪酸值上升较高。当粮堆上层温度高于22 ℃时，粮仓启动空调控温，防止粮温在夏季期间过度升高，将稻谷脂肪酸值控制在25 mgKOH/100 g以下，有效保证了稻谷储存品质。

3.5 结论

辽宁抚顺直属库高大平房7号仓稻谷储藏一年后，稻谷粮堆不同位置温度和含水量的变化，对粮堆微生物区系及变化有较大的影响。初入库稻谷真菌主要为田间真菌链格孢霉和过渡真菌芽枝状枝孢霉。储藏一年后，粮堆中层及下层优势菌为田间真菌，主要为层出镰刀链孢霉和链格孢霉，所占比例超过60%，因为稻谷含水量为14.5%、温度为10 ℃以下的储存条件有利于田间真菌孢子活性的保持，不会影响储粮的安全；粮堆上层优势菌为储藏真菌，主要为灰绿曲霉，所占比例大于50%，因为上层稻谷夏季温度达到20 ℃左右，有利于储藏真菌的生长，储藏真菌对原携带的田间真菌存在着竞争抑制作用，当储藏真菌占优势时，表明储藏环境温度发生了变化，持续高温可能会对储藏稻谷造成潜在危害。入库含水量14.5%左右的稻谷，采用空调控制粮仓温度在不高于22 ℃的情况下，经过1年储存，稻谷储存状况良好，发芽率基本可以保持在90%左右，脂肪酸值基本低于25 mgKOH/100 g。

本研究对高大平房仓中储藏稻谷粮堆不同位置真菌生长演替规律及其品质变化进行了探索，为储藏稻谷的精准防霉和控霉提供了参考。