黄瓜酵素冻干粉的制作工艺研究

皇甫俊静，赵钰莹，冉 浪，冯美玲，张 豪，李次力

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

黄瓜原产于喜马拉雅山南麓，西汉时期由张骞出使西域带回中原地区，根据《拾遗录》 上说：“隋大业四年避讳，改胡瓜为黄瓜。”黄瓜含水分约95%，性味甘凉，有清热利水、解毒的功效，且能治四肢浮肿、清肺热、解火毒，可降低胆固醇[1]。黄瓜富含蛋白质、糖类、维B2、维C、尼克酸、钙、磷、铁等营养物质，能强心降压、预防心肌过度紧张和动脉粥样硬化，还可增强记忆力[2]、安神定志、辅助治疗失眠。此外，黄瓜中的黄瓜酶具有强生物活性，可促进机体的新陈代谢；丙醇二酸可抑制人体内糖类转化为脂肪，阻止体内脂肪堆积，具有减肥和预防冠心病的功效[3]。

李时珍的《本草纲目》中有红曲药用价值的记载：“消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷，酿酒，破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤，治女人血气痛及产后恶血不尽，擂酒饮之，良[4]”。红曲菌丝体蛋白质含量高达30%左右，含17 种氨基酸，其中必需氨基酸占7%左右[5]。根据中医理论，利用红曲与中药材复配，中医理论认为高血脂基本病机为脾失健运、痰浊内生，健脾化痰、活血化瘀是治疗高血脂症的根本原则[6]，若与黄瓜合理配伍，从本源上改善高血脂患者体质，则可发挥更大的作用。

酵素是一种在日本和我国台湾非常流行的植物性功能食品，又称为酶，是产生于生物体内具有催化作用的活性大分子[7]。酵素作为一种生物催化剂参与机体代谢活动[8-10]。目前，关于使用红曲酶对黄瓜进行二次发酵的代餐酵素鲜有报道，试验在前期试验的基础上，选择温度、pH 值、碳源补充量3 个主要因素探究其对发酵代谢物酶活性的影响程度，以期为优质果蔬代餐的生产提供参考。

试验以黄瓜为原料，发酵工业中常用的酵母菌和红曲酶菌为发酵菌种，通过榨汁、发酵、离心、干燥等步骤，制成黄瓜酵素产品，以POD 酶活性为评价指标，对黄瓜酵素的发酵工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

新鲜黄瓜、酵母菌、红曲酶菌、白砂糖，均为市售；过氧化氢、愈创木酚，均为化学纯；醋酸、醋酸钠，均为分析纯。

1.2 试验仪器与设备

BPH-9162 型精密恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；DT5-1 型低速自动平衡离心机，北京时代北利离心机有限公司产品；JA5003 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；722 型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；Pilot2-4LD 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；PHS-2F型pH 计，上海圣科仪器设备有限公司产品。

1.3 工艺流程

黄瓜→冷冻榨汁→加入蔗糖调配→酵母活化后接种→一次发酵→过滤→灭菌→红曲酶活化后接种→二次发酵→过滤→灭菌→酵素原液→冷冻干燥→酵素粉。

1.4 操作要点

（1）原材料预处理。用清水将新鲜的黄瓜清洗干净后，冷冻2～3 d（5～10 ℃），自然解冻、去皮、切碎，添加与黄瓜同质量的水于榨汁机中榨汁，经纱布过滤后，再用离心机过滤[11]。

（2）一次发酵。取一定量酵母置于质量浓度为30 g/L 的蔗糖溶液中，混匀，于35 ℃条件下恒温水浴活化30 min；黄瓜汁中加入活化酵母种子液，搅拌均匀后置于培养箱中恒温发酵。

（3）二次发酵。将一定量红曲霉用适量水润湿，于35 ℃条件下恒温水浴活化1 h；将活化后的红曲霉和杀菌后的一次发酵液混匀后置于培养箱中恒温发酵。

（4）过滤、杀菌。一次或二次发酵完毕需将发酵液真空抽滤，滤液于65 ℃条件下恒温水浴30 min，而后自然冷却至室温[12]。

（5）冷冻干燥。将发酵液分批导入培养皿中，置于-20 ℃以下的低温冷冻冰箱中冷冻48 h，再放入冷冻干燥机中，先在-80 ℃条件下冷藏24 h，于-80 ℃条件下抽真空24 h，最终得到粉末状产品[13]。

1.5 酵母菌一次发酵单因素试验

1.5.1 酵母菌发酵的最佳发酵温度确定

经预试验后，为使黄瓜汁发酵充分，初始pH 值5.0，补充碳源量7%，发酵温度分别设为22，25，28，31，34，37 ℃，发酵24 h；待发酵完毕，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定初始发酵的最佳发酵温度。

1.5.2 酵母菌发酵所需最佳发酵时间确定

将恒温发酵温度34 ℃，补充碳源量7%，初始pH 值 5.0，发酵时间依次设为 18，20，22，24，26，28 h；待发酵完毕，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定初始发酵所需最佳发酵时间。

1.5.3 酵母菌发酵的最佳初始pH 值确定

将发酵温度恒定34℃，补充碳源量7%，初始pH 值分别设为 3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，6.0，控制恒温26 h；待发酵完毕，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定初始发酵的最适初始pH 值。

1.5.4 酵母菌发酵最佳碳源补充量确定

由预试验结果，将发酵温度恒定34 ℃，初始pH 值5.0，补充碳源量依次设置为1%，3%，5%，7%，9%，11%，恒温26 h 发酵后，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定初始发酵的最佳补充碳源量。

1.6 正交试验优化黄瓜酵素酵母菌发酵的最佳发酵条件

经单因素试验可知，发酵温度、发酵时间、初始pH 值、碳源补充量是影响酵母菌初次发酵黄瓜汁的主要因素。因此，以POD 活性为评价指标来设计正交试验，探究酵母菌初始发酵黄瓜汁的最佳制备工艺。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交验因素与水平设计

1.7 红曲霉菌发酵单因素试验

1.7.1 确定红曲霉菌发酵的最佳初始pH 值

初始发酵pH 值会影响发酵产品的发酵速率和品质。由预试验测定结果，将发酵温度恒定34 ℃，红曲酶接种量10%，分别调节pH 值为3，4，5，6，发酵50 h 后，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定红曲霉菌发酵黄瓜的最适pH 值。

1.7.2 确定红曲霉菌发酵的最佳红曲霉接种量

恒温发酵温度34 ℃，pH 值4.0，红曲霉接种量分别为0，5%，10%，15%，20%，在此基础上发酵50 h 后，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定红曲霉菌发酵黄瓜的最佳接种量。

1.7.3 确定红曲霉菌发酵的最佳发酵时间

发酵温度恒定34 ℃，pH 值4.0，红曲霉接种量10%，在此基础上发酵时间依次设为40，50，60，70 h 进行发酵。发酵完毕后，从培养箱中取适量发酵液检测，以POD 酶活性为测定指标，确定红曲霉菌发酵黄瓜的最佳发酵时间。

1.8 二次发酵产物真空冷冻干燥

将发酵液分批导入培养皿中，置于低温冷冻冰箱中，于-20 ℃以下冷冻48 h，再放入冷冻干燥机中先-80 ℃冷藏24 h，再进行-80 ℃真空冷冻干燥，真空度5～15 Pa，干燥时间24 h，最终得到黄瓜汁酵素粉末状产品。

1.9 POD 活性测定

发酵液全部置入离心管，以转速5 000 r/min 离心，于4 ℃条件下保持2 min，酶的粗提取液为上清液。将4 mL 反应液（醋酸缓冲液2 mL，酶液1 mL，0.05 mol/L 愈创木酚 1 mL）和 1 mL 3%的 H2O2加入试管，即刻摇匀并快速倒入1 mL 比色皿中，于波长470 nm 处用722 型可见分光光度计比色，即刻记录吸光度，隔30 s 记一次，共记5 min，用缓冲液取代酶液作对照。

式中：ΔOD——反应起始速度阶段的吸光度差值，比色波长为470 nm；

Δt——ΔOD 对应的时间，min；

Δt/ΔOD——直线部分的斜率，此段吸光度与反应时间成正比；

V1——提取酶液的总体积，mL；

V2——测定时取用的提取酶液体积，mL；

W——黄瓜样品的鲜质量，g；

0.01 ——以吸光度（ΔOD）改变0.01 为1 个酶活单位 （U）[14-16]。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵的试验结果与分析

2.1.1 酵母菌发酵单因素试验

（1）发酵温度对一次发酵酶活性的影响。

发酵温度对一次发酵后酶活性的影响见图1。

由图1 可得以下结论，发酵温度对发酵效果有显著影响，当发酵温度小于34 ℃时，酶活性随时间增加迅速增加；当发酵温度大于34 ℃时，酶活性有骤减趋势。因此，最佳发酵温度为34 ℃。

（2）发酵时间对一次发酵酶活性的影响。

发酵时间对一次发酵后酶活性的影响见图2。

图1 发酵温度对一次发酵后酶活性的影响

图2 发酵时间对一次发酵后酶活性的影响

由图2 可知，发酵时间对发酵效果有显著影响。当发酵时间小于26 h 时，酶活性随时间增加而迅速增加；当发酵时间大于26 h 时，酶活性有下降趋势。因此，最佳发酵时间为26 h。

（3）初始pH 值对一次发酵酶活性的影响。

初始pH 值对一次发酵后酶活性的影响见图3。

图3 初始pH 值对一次发酵后酶活性的影响

由图3 可知，初始pH 值对一次发酵后酶的活性影响趋势较显著，当初始pH 值为5.0 时，发酵效果最佳。因此，发酵最佳初始pH 值为5.0。

（4）碳源补充量对一次发酵酶活性的影响。

碳源补充量对一次发酵后酶活性的影响见图4。

图4 碳源补充量对一次发酵后酶活性的影响

由图4 可知，碳源补充量对二次发酵后酶的活性影响趋势较显著，相比之下，当发酵碳源补充量为3%时，发酵效果最佳。因此，发酵最佳碳源补充量为3%。

2.1.2 酵母菌发酵的正交试验

黄瓜酵素酵母菌发酵正交试验结果见表2，黄瓜酵素酵母菌发酵正交试验方差分析见表3。

表2 黄瓜酵素酵母菌发酵正交试验结果

表3 黄瓜酵素酵母菌发酵正交试验方差分析

由表2 可知，以POD 酶活性为评价指标测得发酵液中POD 酶活性知，4 个因素对酵母菌发酵黄瓜汁有不同影响，且影响作用大小不同。按影响作用大小排序为A>B>C>D，最佳组合的结果为A1B3C1D4，其中发酵时间对整个试验的影响作用较其他3 个影响因素偏小。

2.2 红曲霉菌发酵单因素试验

2.2.1 发酵pH 值对二次发酵后酶活性的影响

发酵pH 值对二次发酵后酶活性的影响见图5。

由图5 可知，发酵pH 值对二次发酵后酶的活性影响趋势较显著，当发酵pH 值为4.0 时，发酵效果最佳。因此，发酵最佳pH 值为4.0。

2.2.2 红曲霉接种量对二次发酵后酶活性的影响

红曲霉菌接种量对二次发酵后酶活性的影响见图6。

图5 发酵pH 值对二次发酵后酶活性的影响

图6 红曲霉菌接种量对二次发酵后酶活性的影响

由图6 可知，红曲霉菌接种量对发酵效果的影响较显著，当接种量小于10%时，酶活性随接种量的增加而增大；但当其接种量大于10%时，酶活性有下降趋势。因此，红曲霉菌的最佳接种量为10%。

2.2.3 发酵时间对二次发酵后酶活性的影响

发酵时间对二次发酵后酶活性的影响见图7。

图7 发酵时间对二次发酵后酶活性的影响

由图3 可知，发酵时间对发酵效果有显著影响，当发酵时间小于50 h 时，酶活性随时间增加而迅速增加；当发酵时间大于50 h 时，酶活性则随发酵时间增加迅速减小。因此，最佳发酵时间为50 h。

2.3 真空冷冻干燥二次发酵产物

该产品色泽呈红色，无小块聚集的粉末，口感清新，有香气，有甜味；理化指标为水分含量≤7%，过氧化物歧化酶含量≥30±3 U/g。

3 结论

以黄瓜为原料，采用工业生产中常用的酿酒酵母和红曲霉菌为菌种，通过正交试验和单因素试验，得到了一次发酵和二次发酵的最佳条件。一次发酵的最佳条件为发酵温度34 ℃，初始pH 值5.0，碳源补充量3%，发酵时间26 h；二次发酵的最佳条件为发酵时间50 h，发酵pH 值4，红曲霉接种10%。冷冻干燥的最佳条件为-80 ℃真空冷冻干燥，真空度5～15 Pa，时间24 h，最终得到粉末状酵素产品。在今后的研究中，可尝试用其他菌种发酵，丰富产品的营养和保健功能，增加产品的附加值。