鲜干石斛水提物抗氧化活性差异比较

杨俊杰，干子健，代欢欢，郭 娜，张方艳

（合肥师范学院生命科学学院，安徽合肥 230601）

石斛为传统名贵药材，在我国已有2 000 多年的药用历史，早在《神农本草经》 《本草纲目》等著作中就有记载，并列居上品[1]。石斛大多分布在哈巴450～900 m 的温凉高湿地带，受小环境相对温度、湿度、光照等气候因子影响较大[2]。人体内自由基处于不断产生和清除的动态平衡中。但是人体与外界的接触过程中，受到外界的影响导致人体内的自由基不断产生，过量的自由基会侵袭人体细胞组织，从而导致机体的氧化损伤，进而引起机体衰老及各种疾病的发生[3-4]。而抗氧化剂能有效抑制自由基，因而寻找合适的抗氧化剂成为当务之急。植物是抗氧化剂的主要来源之一，石斛是药用植物中研究比较热门的一类。通过大量的试验，人们已对石斛也有了一定了解。对不同品种石斛之间成分含量的差异也了解了许多。石斛中的主要有效成分为多糖和生物碱等[5]。药理学研究表明，一些植物多糖有调节机体免疫功能、抗消化性溃疡、降血脂、降血糖、抗肿瘤等方面的生物活性[6]。另外，通过对石斛提取物中的成分（如多糖）研究，发现这些成分对ABTS+·，DPPH·，NO 等均具有一定的清除能力[7-9]。对于石斛中的酮类及其他提取物的生化活性也有较多的研究[10-11]，但是同一品种新鲜石斛与干制石斛水提物抗氧化活性鲜有报道。试验在新鲜石斛干制比为5∶1的条件下比较鲜、干石斛水提物抗氧化活性差异，确定鲜条石斛炮制成干制石斛后其药性的变化情况，从而提高新鲜石斛在干制过程中的利用率，并且为在某些药品或保健品生产时用新鲜石斛代替干制石斛提供依据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜条金钗石斛、干制金钗石斛，产自广西百色；邻苯三酚、菲洛嗪等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JA2603 型电子天平，上海市安亭电子仪器厂产品；UV-Vis 型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司产品；FA220 型分析天平，上海市安亭电子仪器厂产品；TA-XTplus 型粉碎机，超技仪器有限公司产品；DHG-9140 型电热恒温鼓风干燥箱，上海三发科学仪器有限公司产品；PSB 型实验室用离心机，上海江东仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 材料处理

挑选饱满鲜条金钗石斛，清洗后备用。干制金钗石斛截断后放入粉碎机中充分粉碎，再用100 目筛2 遍后收集入袋中。

1.3.2 提取液的制备

（1）鲜条石斛水提物的制备。取20 g 鲜条石斛截成0.5 cm 左右的小段，加入50 mL 蒸馏水，浸泡1 h 后，加热回流3 h。过滤后取滤渣，加入50 mL蒸馏水，再次加热回流3 h。将2 次滤液合并后加入旋转蒸发仪中蒸发浓缩，将浓缩液置于离心机中以转速5 000 r/min 离心10 min。取离心液上清液定容至200 mL，置于容量瓶中保存待用。

（2）干制石斛水提物的制备。取4 g 干制石斛粉加入50 mL 蒸馏水，加热回流3 h。过滤后取滤渣，加入50 mL 蒸馏水，再次加热回流3 h。将2 次滤液合并后加入旋转蒸发仪中蒸发浓缩，将浓缩液置于离心机中以转速5 000 r/min 离心10 min。取离心液上清液定容，移至200 mL 容量瓶中保存待用。

1.3.3 对清除DPPH 自由基能力的测定

称取少量DPPH 溶液，加入无水乙醇配制成质量浓度0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。然后分别取2 mL 不同质量浓度（2， 4，6，8，10 mg/mL）的石斛水提物溶液，加入2 mL DPPH 溶液，混合均匀，放置于水浴锅中25 ℃水浴20 min。然后，将其放入离心机中，以转速5 000 r/min 离心10 min。取上清液于波长517 nm 处测吸光度。用维C 作为阳性对照。计算公式如下所示：

式中：A0——2 mL 无水乙醇+ 2 mL DPPH 溶液的吸光度；

A1——2 mL 样品溶液+ 2 mL DPPH 溶液的吸光度；

A2——2 mL 样品溶液 + 2 mL 无水乙醇的吸光度。

1.3.4 对Fe2+离子螯合能力的测定

分别取1mL不同质量浓度（2，4，6，8，10mg/mL）的样品溶液于试管中，加入3.7 mL 的蒸馏水，再加入 2 mmol/L 的 FeCl2溶液 0.1 mL 和 5 mmol/L 的菲洛嗪溶液0.25 mL，混合均匀后置于水浴锅中，于25 ℃下水浴15 min，于波长562 nm 处测定吸光度。以维C 为阳性对照。计算公式如下所示：

式中：A0——1 mL 蒸馏水代替反应体系中样品溶液的吸光度；

A1——样品溶液反应后的吸光度；

A2——0.1 mL 的蒸馏水代替反应体系中的FeCl2溶液后的吸光度。

1.3.5 对超氧自由基清除率的测定

取 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 （pH 值 8.2）4.5 mL于试管中，置于25 ℃水浴中保温20 min，分别加入1 mL 不同质量浓度 （2，4，6，8，10 mg/mL）样品溶液和25 mmol/L 邻苯三酚溶液0.4 mL，混匀后放置于水浴锅中，于25 ℃水浴中反应5 min，最后加入8 mmol/L HCl 溶液1 mL 终止反应，于波长299 nm处测定吸光度，同时以相同体积蒸馏水代替样品作为空白对照。以维C 为阳性对照。计算公式如下所示：

式中：A0——空白对照溶液吸光度；

A1——样品溶液吸光度。

1.3.6 抗氧化活性的IC50值的测定使用软件Origin Pro 7.5 计算抗氧化活性的IC50。

2 结果与分析

2.1 鲜、干金钗石斛水提物对DPPH 自由基的清除效果比较

鲜、干石斛水提物对DPPH 自由基清除活性的比较见图1。

从图1 可以看出，鲜、干金钗石斛水提物对DPPH自由基均有较强的清除作用。随着石斛水提物质量浓度的增大，鲜、干金钗石斛水提物对DPPH 自由基清除效果也逐渐加强，且上升趋势比较稳定。在石斛水提物质量浓度达到10 mg/mL 时，鲜、干金钗石斛水提物都显示了较强的对DPPH 自由基的清除能力，鲜条金钗石斛水提物对DPPH 自由基的清除率为62.1%，而干制金钗石斛为58.7%。从总体来说，鲜、干金钗石斛水提物对DPPH 自由基清除效果弱于维C。当鲜、干金钗石斛水提物质量浓度相同时，鲜条金钗石斛水提物对DPPH 自由基清除效果强于干制金钗石斛水提物。

图1 鲜、干石斛水提物对DPPH 自由基清除活性的比较

2.2 鲜、干金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除能力比较

鲜、干金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除活性的比较见图2。

图2 鲜、干金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除活性的比较

由图2 可知，鲜、干金钗石斛水提物对Fe2+均有较强的螯合清除作用，其螯合清除效果随石斛水提物质量浓度的增大而变强。在石斛水提物质量浓度达到10 mg/mL 时，鲜、干金钗石斛水提物均显示了较强的对Fe2+螯合清除效果，鲜条金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除率为65.8%，而干制金钗石斛为62.6%。当质量浓度为8 mg/mL 左右时，鲜、干金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除能力与维C 的差距最大。同一质量浓度下，干制金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除效果比鲜条金钗石斛水提物对Fe2+螯合清除效果差一些。

2.3 鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基清除活性的比较

鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基清除活性的比较见图3。

图3 鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基清除活性的比较

由图3 可知，鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基均有较强的清除作用。在石斛水提物质量浓度为2～6 mg/mL 时，其清除超氧自由基能力上升趋势较快；在质量浓度为6～8 mg/mL 时，其清除自由基能力的上升趋势开始变得平缓。同时，鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基的清除能力均小于维C。当质量浓度为2 mg/mL 时，鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基的清除能力与维C 的差异并不明显。当质量浓度达到6 mg/mL 时，鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基的清除能力与维C 的差距最大。此后，随着质量浓度的增加，鲜、干金钗石斛水提物对超氧自由基的清除能力与维C 的差距逐渐缩小。同一浓度下干制金钗石斛水提物清除超氧自由基的效果比鲜条金钗石斛水提物清除超氧自由基的效果差一些。

2.4 抗氧化活性的IC50 值

鲜、干石斛水提物抗氧化活性IC50见表1。

表1 鲜、干石斛水提物抗氧化活性IC50

由表1 可知，鲜、干金钗石斛水提物清除DPPH自由基和超氧自由基的螯合Fe2+等抗氧化试验中，鲜条金钗石斛水提物清除DPPH 自由基和超氧自由基，螯合Fe2+的IC50都小于干制金钗石斛。鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性要弱于维C 对照。

2.5 鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性差异显著性分析

鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性差异显著性分析见表2。

表2 鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性差异显著性分析

由表2 可知，通过清除DPPH 自由基、螯合Fe2+、清除超氧自由基能力这3 种方法测定的鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性，两者之间并不存在显著差异。即鲜、干金钗石斛水提物抗氧化活性差异不大。

3 结论

从这3 种方法的试验结果及计算所得抗氧化活性IC50可知，鲜条金钗石斛和干制金钗石斛的水提物都有较强的抗氧化活性。虽然鲜、干金钗石斛抗氧化活性并无明显差异，但鲜条金钗石斛水提物的抗氧化活性高于干制金钗石斛水提物的抗氧化活性。由此说明鲜条石斛在干制过程中，受到外界环境或者干制技术的影响，使新鲜石斛中含有的某些抗氧化物质遭到破坏，从而导致干制石斛中所含的抗氧化物质含量降低。因此，从同一品种石斛的药效来说，新鲜石斛的药效优于干制石斛。同时，所有试验数据是在新鲜石斛干制比为5∶1 的条件下生成的，而一般石斛干制比为5.5∶1 ～6.5∶1。由此可见，新鲜石斛干制过程中会损失一定的生物活性。