水相酶解法提取柚籽油的研究

武 玲，胡爱军，陈 文，郑 捷

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.春金（天津）油脂有限公司，天津 300452）

柚子（Citrus paradisi Macf.），又称文旦、香栾等[1]，是芸香科柑橘属植物，喜欢在温暖潮湿的地方生长，在我国福建、江西、广东、广西等南方地区均有大面积栽培[2]。柚籽是柚子加工或食用的副产物，目前还未得到有效利用，常作为废物丢弃，不仅导致可利用资源的浪费，而且会产生环境污染[3]。柚籽中油脂含量丰富，可达到40 %以上，且富含不饱和脂肪酸[4]，具有增强免疫力、保护心脑血管、提高记忆力、降低血压和血脂的作用[5]，可以作为油料资源进行开发。柚籽油是金黄色的透明液体，在室温下有良好的流动性。

传统的油脂提取方法有压榨法和有机溶剂萃取法[6]，这2 种方法也是工业化生产中油脂的主要提取方法，但是这2 种方法均有其局限性，有机溶剂萃取法会产生溶剂残留，压榨法的出油率低，油脂易氧化，会导致油脂质量下降[7]。随着油脂工业的发展，人们又研究出了水相酶解法、超声波萃取法、超临界CO2萃取法、亚临界流体萃取法等新的提取工艺[8-11]。

水相酶解法是在机械破碎的基础上，利用各种生物酶降解植物细胞壁或溶解细胞中的可溶性物质，同时减少乳状液生成和对已经生成的乳状液进行破乳，使油料得以释放，再利用水油不相容的原理和离心分离的方法将油脂提取出来[12]。水相酶解法具有高效、环保、无残留的特点，发展前景良好[13]。以副产物柚籽为原料，应用水相酶解法提取柚籽油，以提取率作为评价指标，考查酶种类、料液比、酶解温度、酶解时间及酶解pH 值对柚籽油提取效果的影响，通过正交试验得到水相酶解法提取柚籽油的最佳工艺条件，以期为柚籽油的提取和柚籽的开发利用提供技术支撑和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

柚子籽；中性蛋白酶（10 万U/g）、碱性蛋白酶（10 万U/g），南宁庞博生物工程有限公司提供；复合果胶酶（果胶酶+纤维素酶，1∶1；10 万U/g），浙江嘉合生物科技有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

CS-700 型高速多功能粉碎机，永康市天祺盛世工贸有限公司产品；FA2204B 型电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品；SHZ-82A 型恒温振荡器，常州国华电器有限公司产品；BIOS 16 型大容量台式离心机，赛默飞世尔科技公司产品；DL-106型电热鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 水相酶解法提取柚籽油工艺流程

1.3.2 水相酶解法提取柚籽油操作要点

将柚籽粉碎、烘干，称取一定质量柚籽粉，加入适量的蒸馏水搅均成浆，在沸水浴中灭酶1 h。冷却后向匀浆中加入适量酶，将其放入恒温水浴中进行酶解反应（以转速120 r/min 搅拌）。酶解结束后，进行第1 次离心（以转速4 000 r/min 离心10 min），分离出乳化层进行破乳，然后第2 次离心（以转速4 000 r/min 离心10 min），将2 次离心得到的游离油置于干燥箱中，在105 ℃条件下烘干至恒质量，称得其质量。柚籽油提取率的计算公式为：

1.3.3 酶种类对提取率的影响

称取适量柚籽粉，料液比1∶5（g∶mL），调节pH 值，加入定量酶，于50 ℃的恒温摇床中进行酶解反应（以转速120 r/min 搅拌），酶解时间3 h。分别比较碱性蛋白酶（1%，pH 值10.0）、中性蛋白酶（1%，pH 值 7.0）、复合果胶酶 （1%，pH 值 4.0）、碱性蛋白酶+复合果胶酶（0.5%+0.5%，pH 值6.0）、中性蛋白酶+复合果胶酶（0.5%+0.5%，pH 值5.0）作用下的提取率，选择出提取柚籽油的最适单酶或多酶。

1.3.4 料液比对提取率的影响

称取适量柚籽粉，加入蒸馏水，调节pH 值至6.0，加入碱性蛋白酶（0.5%）+复合果胶酶（0.5%），于50 ℃恒温摇床中进行酶解反应（以转速120 r/min搅拌），酶解时间3 h。研究料液比分别为1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8 时柚籽油的提取率，选择出提取柚籽油的最适料液比。

1.3.5 酶解时间对提取率的影响

称取适量柚籽粉，料液比1∶5，调节pH 值至6.0，加入碱性蛋白酶 （0.5%）+ 复合果胶酶（0.5%），于50 ℃的恒温摇床中进行酶解反应（以转速120 r/min 搅拌）。研究酶解时间分别为1，2，3，4，5 h 时柚籽油的提取率，选择出提取柚籽油的最适酶解时间。

1.3.6 酶解温度对提取率的影响

称取适量柚籽粉，料液比1∶5，调节pH 值至6.0，加入碱性蛋白酶 （0.5%）+ 复合果胶酶（0.5%），调节恒温摇床温度，达到温度后放入原料进行酶解反应（以转速120 r/min 搅拌），酶解时间3 h。研究酶解温度分别为30，40，50，60，70 ℃时柚籽油的提取率，选择出提取柚籽油的最适酶解温度。

1.3.7 酶解pH 值对提取率的影响

称取适量柚籽粉，料液比1∶5，调节pH 值，加入碱性蛋白酶（0.5%）+复合果胶酶（0.5%），在50 ℃恒温摇床中进行酶解反应（以转速120 r/min 搅拌），酶解时间3 h。研究酶解pH 值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 时柚籽油的提取率，选择出提取柚籽油的最适酶解pH 值。

1.3.8 最佳提取工艺条件的确定

根据单因素试验结果，以酶解pH 值、酶解温度、酶解时间为参考因素，以柚籽油提取率为指标，设计L9（34）正交试验以优化提取工艺。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 酶种类对提取效果的影响

酶种类对柚籽油提取率的影响见图1。

由图1 可知，碱性蛋白酶+复合果胶酶的提取效果最好，而复合果胶酶的提取效果最差。其可能是因为柚籽细胞壁的主要成分为果胶、纤维素等[14]，当单独使用复合果胶酶时，虽然细胞壁被降解，但柚籽细胞组织内的油脂还在以脂蛋白、脂多糖等复合体的形式存在[15]，油脂的流动性较差，因此复合果胶酶的提取效果最差；只添加蛋白酶时，柚籽的细胞壁被破坏程度小，油脂不易从细胞内释放出来，因此只添加蛋白酶时提取效果也不理想；同时添加蛋白酶和果胶酶时，可以使油脂顺利释放出来。综上，选用碱性蛋白酶和复合果胶酶进行柚籽油的提取效果最好。

图1 酶种类对柚籽油提取率的影响

2.2 料液比对提取效果的影响

料液比对柚籽油提取率的影响见图2。

图2 料液比对柚籽油提取率的影响

料液比是通过影响底物与酶的接触面积而影响柚籽油的提取率。由图2 可知，当料液比为1∶4时，水的添加量少，体系的黏度大，柚籽粉与酶的流动性差，酶的作用效果低，不利于反应的持续发生，因而提取率较低。随着水的添加量增多，有利于柚籽粉与酶充分接触，柚籽粉与酶之间的接触面积增大，传质速率提高，从而使提取率升高。当料液比减小至1∶5 时，柚籽油的提取率达到最大。当添加的水过量时，反应体系中底物浓度和酶浓度都降低，底物与酶的撞击机率降低，柚籽粉与酶之间的接触面积减小，酶的作用效果降低，提取率逐渐下降。因此，试验提取率最高时的料液比为1∶5。

2.3 酶解时间对提取效果的影响

酶解时间对柚籽油提取率的影响见图3。

由图3 可知，在酶解初期，提取率会随时间的增加而快速提高，在3 h 时达到峰值，然后处于相对稳定的状态，当反应时间继续延长时，提取率不会再大幅度提高，甚至有所下降。其可能的原因是，在前一阶段底物充足，细胞壁的结构随着时间的延长在酶的作用下会逐渐变得疏松，酶的作用点数也会增加，酶解越来越充分，从而使油的释放量增加；当达到一定时间后，细胞壁结构基本疏散完全，酶解也基本达到平衡；当酶解时间过长时，底物减少，不会再释放出更多的油脂，同时还会使油脂的品质下降[16]。因此，柚籽油提取的最适酶解时间为3 h。

图3 酶解时间对柚籽油提取率的影响

2.4 酶解温度对提取效果的影响

酶解温度对柚籽油提取率的影响见图4。

图4 酶解温度对柚籽油提取率的影响

酶解温度影响酶的活性，从而影响柚籽油的提取率。由图4 可知，在酶解温度达到50 ℃之前，提取率随温度的升高而增大；在50 ℃时，提取率达到最大；当温度高于50 ℃时，提取率随温度的升高而降低。这是由于在一定的温度范围内，酶的活性随着温度的升高而增强，提取率就会随之升高。酶的化学本质为蛋白质，当温度过高时，蛋白质间的分子作用力会被破坏，其高级结构也随之被打破，而酶对于底物的催化活性高度依赖于蛋白质的高级结构，酶的活性降低甚至失活，柚籽油的提取率也随之下降。上述研究结果表明，提取柚籽油的最适酶解温度为50 ℃。

2.5 酶解pH 值对提取效果的影响

酶解pH 值对柚籽油提取率的影响见图5。

由图5 可知，酶的活性受到反应环境的pH 值影响，pH 值过低或过高都会使酶的活性降低，从而影响柚籽油的提取率。pH 值过小时，酶的必需基团离子化，酶与底物结合的能力下降，因而酶的活性被抑制，提取率较低；pH 值过大时，过碱的环境会破坏稳定酶三维结构的非共价键，使酶蛋白变性，酶的活性降低，柚籽油的提取率随之减小。因此，在碱性蛋白酶与复合果胶酶混合使用时的最适pH 值为5.0。

图5 酶解pH 值对柚籽油提取率的影响

2.6 水相酶解法提取柚籽油工艺优化

根据单因素试验的结果，发现酶解pH 值、酶解温度和酶解时间是影响柚籽油提取率的主要因素，因此采用L9（34）正交试验，进行水相酶解法提取柚籽油工艺优化。

正交试验结果见表2，正交试验方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

极差越大，对柚籽油提取率的影响越大，因此由表2 可知，3 个因素对柚籽油提取率的影响大小为酶解温度>酶解时间>酶解pH 值。由表3 可知，酶解温度和酶解时间为显著因素。由表2 可知，当料液比为1∶5，使用碱性蛋白酶+复合果胶酶时，水相酶解结合溶剂萃取法提取柚籽油的最适提取参数为A2B2C3，即酶解pH 值为5.0，酶解温度50 ℃，酶解时间4 h。根据正交试验得到的优化工艺条件，进行3 组平行验证试验得到柚籽油的平均提取率为76.08%。

3 结论

通过单因素试验，水相酶解法提取柚籽油的适宜用酶为碱性蛋白酶与复合果胶酶的混合酶，最佳料液比为1∶5，通过正交试验优化后的工艺参数为酶解pH 值5.0，酶解温度50 ℃，酶解时间4 h，此条件下进行柚籽油提取的3 次验证试验表明柚籽油平均提取率为76.08%。各因素对柚籽油提取率的影响大小依次为酶解温度>酶解时间>酶解pH 值，酶解温度和酶解时间为显著因素。研究有必要进行放大试验，为水相酶解法提取柚籽油技术的产业化应用奠定基础。