复方杜仲提取物对海鲈肝脏修复作用的研究

陈雪影 柴文君 叶彩燕

摘 要：为了评估复方杜仲提取物对海鲈夏季高温期以肝肿大为特征的消化系统症状修复作用，将150尾健康海鲈设置3个平行，每个平行随机分5组（1个常温组、4个高温组），常温组和高温组分别在（27±0.5）℃、（33±0.5）℃处理2周。试验期间饱食投喂普通饲料，2周后高温组肝脏出现了肝细胞肿胀、空泡变性等组织病变，对高温组分别投以0、1∶6、1∶4、1∶2复方杜仲提取物水平的饲料，常温组投喂普通饲料，2周后高温组血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量均显著降低（P<0.05）;且下降幅度随中草药添加量增加而增大，1∶2试验组ALT和AST均极显著低于高温对照组（P<0.01）;病理组织学结果显示，高温组肝细胞损伤修复程度与复方杜仲提取物比例成正相关。因此，复方杜仲提取物对高温期海鲈肝脏病变具有修复作用，且1∶2试验组效果最好。

关键词：海鲈;高温期;消化系统疾病;病理模型;杜仲提取物

Abstract： In order to evaluate the effect of Eucommia ulmoides extract on repair the hepatomegaly on sea bass because of the high temperature in summer. 150 healthy sea bass were divided into three parallel treatments， which were randomized in one normal temperature group and four high temperature groups. Normal temperature group were treated at the room temperature （（27±0.5）℃）while high temperature groups at the high temperature（（33±0.5）℃）for two weeks. Two weeks later， symptoms such as hepatocyte tumefaction， vacuolation， stenosis of sinus were observed on the pathological histological section in high temperature groups. Then the high temperature groups were fed for 0 （control）， 1∶6， 1∶4， 1∶2 commercial feed diets containing Eucommia ulmoides extract and the normal temperature group was feed for ordinary commercial feed for two weeks. The serum alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were significant decreased （P<0.05） and the decreasing extent with Eucommia ulmoides extract increasing， and the addition of 1∶2 decreased most. Besides， the histopathological results showed that the restorative effects had positively correlation with amount of Eucommia ulmoides extract， which could alleviate the pathological damage of liver. In summary， eucommia ulmoides extract has prominent repair effect on the liver lesions of sea bass， and addition of 1∶2 is the most obvious.

Key words： Sea bass; High temperature period; Digestive symptoms; Pathological model; Eucommia ulmoides

据统计，2018年广东海水鲈鱼池塘养殖面积达6667hm2，产量超20万t，海鲈已成为全国性海水养殖主导品种之一[1]。近年来，实践发现，海鲈精养区夏季高温期间，海鲈容易出现加料难、阶段料比高等问题，解剖发现海鲈肝肿大发白成为共性症状，病理学特征方面主要表现肝细胞空泡变性，肝血窦出現挤压性窦腔狭窄，未见红细胞和白细胞浸润等。海鲈上述肝脏问题持续1～3个月，期间可引起鱼体食欲减退，营养吸收效率低，生长缓慢，免疫水平降低，轻则引起零星死亡，严重时极易结合细菌、病毒等暴发大规模疾病，严重影响海鲈养殖经济效益。

肝脏是鱼类的重要实质器官，与机体消化、解毒、免疫和代谢等功能密切相关[2-4]。养殖环境变化、流行性病害、药物滥用、投喂不当等均会造成鱼体肝脏的病变[3-7]。肝脏作为重要的消化器官，其损伤会引起料比高，消化吸收能力减弱，免疫系统紊乱，导致鱼体抗病力下降等，进而引发一系列的养殖问题的出现[4-6]。温度是影响鱼类生长发育的重要因素之一，众多研究表明，高温胁迫造成虹鳟、石斑鱼、牙鲆、大黄鱼等生长率、存活率降低，引发肝脏损伤，甚至死亡[8-12]。夏季高温加上投喂过度则更易引发肝脏损伤，影响鱼类健康生长。目前，对鱼类肝脏疾病的研究，主要集中在草鱼、青鱼、罗非鱼等淡水经济鱼类上，包括发病症状、发病原因、发病规律、不同药物治疗效果等，如脂肪肝、毒性和药源性物质引发的肝中毒等[3-5]。鲈鱼类仅大口黑鲈、梭鲈有相关研究，孙永旭等从免疫学角度研究发现长期高温胁迫对大口黑鲈幼体产生应激损伤，并且肝脏对温度胁迫更敏感，王国成研究发现高温胁迫造成梭鲈肝脏损伤[13-14]。海鲈仅涉及对养殖过程中常见病害的病原病因分析和防治建议等基础研究，尚未见从病理组织学和免疫学角度去研究海鲈肝脏疾病及防治效果的相关报道。因此，探寻防治鱼类肝胆疾病的有效药物具有非常重要的意义。本研究通过高温胁迫构建海鲈肝脏损伤模型，对模型组投喂以添加不同浓度复方杜仲提取物的商品饲料，从组织病理学和免疫学层面探讨中草药制剂防治的有效性，为研究中草药制剂作为海鲈保肝药物的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验鱼 试验用海鲈购自珠海市斗门区一精养池塘，共150尾，平均体重（100.0±5.0）g。海鲈全价商品饲料购自市场，产品主要成分见表1。含复方杜仲提取物中草药制剂是广东海大集团股份有限公司自主研制及生产的专利产品。血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）酶采用试剂盒进行测定，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 试验养殖管理 养殖用水为经全循环系统曝气净化的自来水。试验期间持续增氧，水体pH7.0～7.8，水温27℃，溶解氧7.0～8.0mg/L，每天上、下午各投饵1次（10∶00、16∶00），试验期间饱食投喂。

1.2.1 试验分组及高温模型的构建 试验组分为1个常温组（27±0.5℃）和4个高温组（33±0.5℃），每组3个平行，10尾/组，各饲养在容积为200L的圆柱形水族箱中。室温（27±0.5）℃进行暂养5d后，高温组加入加热棒，使水体以1℃/d的速度升温，升至（33±0.5）℃后维持2周，常温组不升温，造模期间各组均投喂海鲈全价商品饲料。

1.2.2 投喂复方杜仲提取物中草药制剂 基于前期预试验结果，造模2周后，每组随机选取一平行全部解剖，取样做病理组织切片分析。确定已成功构建海鲈肝脏病理损伤模型后，将高温组分为高温对照组和3个试验组，普通组不变。常温组和高温对照组投喂常规配合饲料，高温试验组投喂常规配合饲料和中草药饲料混合物，中草药制剂和常规饲料比例分别为1∶6、1∶4和1∶2。高温组（33±0.5）℃、常温组（27±0.5）℃继续维持2周。

1.3 样品采集及肝组织病理组织学观察 试验结束后，禁食24h，每组随机取3尾鱼用于尾静脉采血，静置4h后以4000rpm/min、4℃条件下离心10min，收集血清，试剂盒检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量。同时取鱼的肝脏制作组织切片，光学显微镜观察组织切片。

1.4 数据处理 试验结果以平均值±标准误差形式表示。采用SPSS统计学软件对试验数据进行统计分析，差异具有统计学意义的标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 海鲈肝脏损伤模型 造模2周后，与常温组相比，高温组肝组织均出现一定程度的病理特征：肝细胞肿胀、体积增大、胞浆染色变浅、空泡变性、肝血窦狭窄、血细胞减少（图1 A1-A2）。

2.2 投喂不同比例的復方杜仲提取物中草药对海鲈肝脏修复的影响

2.2.1 肝脏组织形态 投喂复方杜仲提取物中草药制剂后，与高温对照组比较，各高温试验组肝组织均出现不同程度好转，其中1∶2试验组的肝组织修复效果最好。1∶6和1∶4试验组肝组织结构正常，肝细胞的损伤程度有所降低，空泡变性的程度减轻，肝细胞血窦血流量正常（图1 B1-B2）;1∶2试验组肝血窦丰度较高，肝内血流量大，肝细胞形态整体符合正常范围（图1 C1-C2）。

2.2.2 血清转氨酶检测结果 由表2可知，添加复方杜仲提取物2周后，海鲈血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量均呈降低趋势，且下降幅度随中草药添加量增加而增大，1∶2试验组ALT和AST均极显著低于高温对照组（P<0.01），与常温组差距最小。1∶4试验组ALT和AST虽与高温对照组相比有显著差异，但与常温组差距较大。因此，1∶2试验组修复效果最好。

3 讨论

肝脏是鱼类重要的消化、免疫、代谢、解毒器官，在集约化养殖的情况下，肝脏疾病的发生已成为限制水产养殖快速、健康发展的重要问题[3-7]。闫少静、汪开毓、介子林等研究表明，肝脏损伤或病变往往会引起鱼类免疫系统紊乱、抗病力下降，并极易引发其他疾病暴发，造成鱼类大量死亡[4-6]。肝脏是机体内代谢最为旺盛的组织器官之一，Lushchak研究表明热应激可使肝脏氧化还原反应明显增强，进而产生大量活性氧造成肝细胞损伤，李大鹏、童娜等发现对损伤的适应性反应常引起细胞结构改变，当细胞膜通透性改变、细胞内水分增加时，即出现细胞肿胀、水泡变性，所以长期高温容易引发鱼类肝脏疾病[15-17]。管标、Aboka、李佳凯等研究表明虹鳟、鳙鱼、大黄鱼等受到高温胁迫后，应激反应强烈，肝脏发生损伤[11，18-19]。汪开毓、周宁、杜震宇等对鱼类肝脏疾病分析发现，饲料投喂不当，包括蛋白质含量过高、维生素缺乏、投喂过度等，也是引发肝脏疾病的一类重要原因[2，4，20]。本试验结果显示，高温期间饱食投喂能够引发海鲈肝脏损伤，主要病理组织学症状为肝细胞肿大、肝细胞发生空泡变性。

Aboka、邵彦翔等研究表明急性细胞肿胀是一种早期的、完全可逆的损伤[9，19]。中草药因其疗效好、无残留等优点，开发对肝脏具有保护作用的中草药是目前研究的热点[21，24]。农业部推荐养殖生产中使用的GMP中草药有多种，多用于抗菌治疗，且存在普适性、对症性差等弊端。刘英娟、白洁、谢炎福等研究发现，枸杞多糖、叶下珠、当归提取物、甘草提取物、黄芪提取物、姜黄素、黄芩、垂盆草等对肝脏具有良好的保护和损伤修复效果[23，25-27]。但目前这些研究成果多停滞在基础理论研究层面，距离快速实现产品化及投入市场应用还很遥远。所以解决此类肝脏疾病对于推动水产行业的健康发展具有重大意义。杜仲是我国特有的经济林资源和名贵药材，其化学成分多样且复杂，生物活性广泛，具有保肝护肾、抗炎、提高生长性能等药理作用[28-31]。近年来，关于杜仲修复肝细胞、调节养殖动物免疫作用的报道在畜禽和淡水鱼方面报道较多，罗庆华、高银辉、王建辉等研究表示添加杜仲提取物能提高机体免疫应答水平，增强抗肝细胞损伤、抗纤维化、抗细菌感染能力，而在特种鱼方面相关很少[32-36]。本试验研究发现，内服复方杜仲提取物后，肝细胞组织显著得到改善，肝细胞形态恢复正常，肝细胞排列整齐，血窦丰度正常。而且这种防治效果随着复方杜仲提取物添加量增加而提高，这将更有利于肝脏发挥正常的生理机能，更能促进海鲈的免疫功能及消化吸收进行。免疫学检测指标亦显示，复方杜仲提取物能显著对抗肝损伤海鲈血清中ALT、AST水平的升高，并呈现明显的剂量相关性。试验结果表明复方杜仲提取物对肝脏受损海鲈具有明显的保护作用，孙黎清、戚向阳、刘慧等对其有效成分分析发现，这可能与杜仲所含有的一些化学活性成分如苷类、生物碱、多糖等有关，因为上述活性成分均具有调节动物机体免疫作用[29-30，37]。

4 结论

试验结果表明，饲料中添加复方杜仲提取物对受损海鲈肝组织有修复作用，还能显著降低血清ALT和AST活性。因此，复方杜仲提取物对受损海鲈肝脏有保护作用，并具有促进机体免疫机能恢复作用，可以作为一种保肝制剂。

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