黑果枸杞果实提取物中花色苷对酪氨酸酶活性的抑制作用初探

黄佳楠，管福琴，李林蔚，李晓莺，禄 璐，米 佳，刘兰英，①，陈 雨，①

〔1.江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)江苏省植物资源研究与利用重点实验室江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014；2.宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，宁夏 银川 750002〕

酪氨酸酶广布生物体内，为催化黑色素合成的关键限速酶[1]，可催化L-酪氨酸(L-Tyr)生成L-多巴(L-DOPA)，并氧化L-DOPA形成多巴醌，该酶在上述反应中分别被称为酪氨酸酶单酚酶和酪氨酸酶二酚酶[2]。酪氨酸酶抑制剂是美白产品的重要成分，目前主要为曲酸和对苯二酚等，对人体有一定的副作用[3]。植物体内天然的多酚类成分可安全、有效地抑制酪氨酸酶活性[4-6]，为近年来美白产品研发的重点。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)可补肾益精、养肝明目、补血安神[7]，并具有抗氧化、抗衰老及调节免疫等作用[8-9]，其果实中的花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老和美白保湿等作用[9-10]，可作为美白产品原料[11]。为了明确黑果枸杞果实中花色苷的美白功效，作者鉴定了其果实提取物活性导向分离的2个花色苷的结构，比较了二者对酪氨酸酶活性的抑制率，并研究了其与酪氨酸酶的分子对接状况，以期为黑果枸杞果实中花色苷的美白机制研究及其美白产品质量标准制定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试花色苷1和花色苷2从黑果枸杞品系‘W-13-10-01’的成熟干燥果实(采自宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所芦花台枸杞种植基地)提取物中经活性导向分离获得。

主要试剂：L-Tyr、L-DOPA、酪氨酸酶和曲酸均为分析纯级，购自美国Sigma公司；乙腈为色谱纯级，购自美国Tedia公司；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾均为分析纯级，购自南京化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 LC-MS分析 使用Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI Q-TOF MS液质联用仪(美国Agilent公司)进行检测分析，色谱柱为ZORBAX SB C18(1.8 μm，4.6 mm×100 mm)。流动相为乙腈(A)和体积分数0.1%甲酸溶液(B)的混合液，采用体积分数18%A等度洗脱15 min，流速0.3 mL·min-1，检测波长310 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。质谱条件为：ESI离子源，正离子模式(m/z1 000-3 200)；雾化器压力50 psi；干燥气流速10 mL·min-1，温度350 ℃；毛细管电压4 000 V，Fragmentor电压205 V；MS/MS碰撞能量35 V。

1.2.2 对酪氨酸酶活性的抑制分析 以L-Tyr和L-DOPA为底物，并对文献[12]的方法稍作调整。将50 μL花色苷溶液、50 μL PBS缓冲液(pH 6.8)和50 μL 100 U·mL-1酪氨酸酶溶液加入96孔板中，每个花色苷设4个技术重复，37 ℃孵育10 min；加入100 μL底物，37 ℃孵育5 min；用Infinite M200多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)测定反应液在波长475 nm处的OD值，每组实验重复3次。以14.21 μg·mL-1曲酸为阳性对照，初筛时，花色苷质量浓度为200.00 μg·mL-1，选择对酪氨酸酶活性抑制率高于50%的花色苷进行梯度分析，质量浓度设为12.50、25.00、50.00、100.00和200.00 μg·mL-1。花色苷对酪氨酸酶活性抑制率(IR)的计算公式为IR=〔1-(ODC-ODD)/(ODA-ODB)〕×100%，式中，ODA、ODB、ODC和ODD分别为阴性对照组(加PBS和酶)、空白组(只加PBS)、实验组(加样品和酶)和实验对照组(加样品和PBS)反应液的OD值。依据花色苷质量浓度-酪氨酸酶活性抑制率曲线计算花色苷对酪氨酸酶活性的半抑制浓度(IC50)。

1.2.3 与酪氨酸酶的分子对接 采用AutoDock-Vina软件[13]进行分子对接，采用拉马克遗传算法(LGA)进行计算，以半经验势函数为能量打分函数对小分子构象和位置进行全局搜索。计算过程中受体格点盒子为20 Å×20 Å×20 Å，格点间距1 Å，格点盒子包围配体活性腔；能量评估和生成最大值分别为250 000和27 000；选择均方根偏差(RMSD)为评价标准，最大容忍范围1 Å。

1.3 数据统计分析

采用EXCEL 2013和SPSS 21.0软件处理和统计实验数据，采用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果和分析

2.1 结构鉴定

花色苷1呈紫红色粉末，具有分子离子m/z933([M+H]+)以及3个碎片离子m/z317([M+H-162-308-146]+)、m/z771([M+H-162]+)和m/z479([M+H-308-146]+)，其裂解方式见图1。1H-NMR(700 MHz，CD3CN，TFA-d3)δ：8.85(s，1H)，7.03(s，1H)，7.06(s，1H)，7.92(d，J=1.5 Hz，1H)，7.81(d，J=1.8 Hz，1H)，3.97(s，1H)；7.50(d，J=8.5 Hz，1H)，6.74(d，J=8.4 Hz，1H)，6.74(d，J=8.4 Hz，1H)，7.50(d，J=8.5 Hz，1H)，6.26(d，J=15.9 Hz，1H)，7.51(d，J=15.9 Hz，1H)；3.70-5.60；3.72-5.22；0.86-4.70。通过化学位移和偶合常数判断香豆酰基的顺反异构类型，结合文献[14-16]鉴定花色苷1为矮牵牛素-3-O-(6′′′′-O-反式对香豆酰)芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷〔petunia-3-O-(6′′′′-O-trans-p-coumaroyl)rutinoside-5-O-glucoside〕。

图1 黑果枸杞果实提取物中花色苷1的ESI-MS裂解方式

Fig.1 ESI-MS cracking mode of anthocyanin 1 from fruit extracts ofLyciumruthenicumMurr.

花色苷2具有分子离子m/z1 095([M+H]+)及与花色苷1相似的离子碎片m/z933([M+H-162]+)、m/z479([M+H-308-146-162]+)和m/z317([M+H-162-308-146-162]+)。1H-NMR(700 MHz，CD3CN，TFA-d3)δ：8.85(s，1H)，7.03(s，1H)，7.05(s，1H)，7.90(d，J=1.5 Hz，1H)，7.80(d，J=1.8 Hz，1H)，3.97(s，1H)；7.50(d，J=8.6 Hz，1H)，7.13(d，J=8.6 Hz，1H)，7.13(d，J=8.4 Hz，1H)，7.50(d，J=8.6 Hz，1H)，6.29(d，J=16.0 Hz，1H)，7.51(d，J=16.0 Hz，1H)；3.50-5.60；3.72-5.22；3.50-5.00；0.86-4.70。结合文献[14，16]，鉴定花色苷2为矮牵牛素-3-O-[6′′′′-O-(4′′′′′-O-葡萄糖基)反式对香豆酰]芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷〔petunia-3-O-[6′′′′-O-(4′′′′′-O-glucosyl)trans-p-coumaroyl)]rutinoside-5-O-glucoside〕。

2.2 对酪氨酸酶活性的抑制作用

初筛时，黑果枸杞果实提取物中花色苷1对酪氨酸酶单酚酶和酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率分别为97.1%和56.5%，而花色苷2对2种酶活性的抑制率仅分别为35.1%和15.5%，故选择花色苷1进行梯度分析，结果见表1。由表1可见：随着质量浓度的提高，花色苷1对酪氨酸酶单酚酶和酪氨酸二酚酶活性的抑制率均逐渐升高，经计算，其对2种酶活性的半抑制浓度(IC50)分别为25.44和153.10 μg·mL-1。

质量浓度/(μg·mL-1)Mass concentration抑制率/% Inhibition rate酪氨酸酶单酚酶Tyrosinase monophenolase酪氨酸酶二酚酶Tyrosinase diphenolase12.5034.0±1.3a3.1±1.1a 25.0045.8±0.3a10.6±1.4b 50.0064.8±3.7b22.7±2.2c100.0085.9±2.3c39.1±3.4d200.0097.1±8.1c56.5±3.6e

1)同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different lowercases in the same column indicate the significant(P<0.05)difference.

2.3 与酪氨酸酶的分子对接

将黑果枸杞果实提取物中花色苷1和花色苷2与酪氨酸酶晶体(PDB ID：2Y9X)进行分子对接模拟，结果见图2。由图2可见：花色苷1和花色苷2的香豆酰基部分深入酪氨酸酶的活性位点，分别与His244和Asn260形成不同强度的氢键，阻止组氨酸与Cu离子间的电子传递，从而抑制酪氨酸酶活性。花色苷1和花色苷2与酪氨酸酶的结合能分别为-7.5和-6.0 kcal·mol-1。

球棍表示花色苷和关键氨基酸残基Sticks represent anthocyanins and key amino acid residues；条带表示酪氨酸酶Bands represent tyrosinase.

图2 黑果枸杞果实提取物中花色苷1(A)和花色苷2(B)与酪氨酸酶晶体结合模式图

Fig.2 Binding pattern of anthocyanin 1(A)and anthocyanin 2(B)from fruit extracts ofLyciumruthenicumMurr.with tyrosinase crystal

研究结果显示：黑果枸杞果实提取物中的花色苷1对酪氨酸酶活性的抑制作用较强，可作为美白产品的功效成分。