一测多评法同时测定小儿止嗽金丹中6种成分含量

刘香叶，赵赛，朱月梅

淮安市第一人民医院，江苏 淮安 223001

小儿止嗽金丹由炒杏仁、桔梗、玄参、知母、麦冬、竹茹、炒紫苏子等15味中药加工而成，具有解热润肺、化痰止嗽的作用，用于外感风热引起的咳嗽痰盛、口干舌燥、腹满便秘等症状的治疗。小儿止嗽金丹现行质量标准为《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第二册，其中未收载任何成分定量检测方法[1]，也未检索到对该制剂所含1种或多组分定量检测的文献报道。中药及其复方制剂所含成分复杂，单一成分难以全面评价该产品质量，多组分质量控制模式已逐步应用于中成药复方制剂中，一测多评法(QAMS)利用中药组分间存在的一定内在函数关系，通过测定1个对照品质量稳定、价格低廉的组分，建立其与其他成分的相对校正因子，达到对该制剂所含多个组分的同时测定。本实验以苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷为检测指标，选取哈巴苷为内参物，建立一测多评法同时检测小儿止嗽金丹中6种活性成分含量，将一测多评检测结果与外标法对比，考察一测多评法的可行性及准确性，为全面评价小儿止嗽金丹的产品质量提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010C型岛津高效液相色谱仪；UltiMate3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔公司)；XSE205DU型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

哈巴俄苷对照品(批号：111730-201709，CAS号：19210-12-9，纯度：95.9%)、哈巴苷对照品(批号：111729-201707，CAS号：6926-08-5，纯度：96.8%)、苦杏仁苷对照品(批号：110820-201808，CAS号：29883-15-6，纯度：88.2%)均来源于中国食品药品检定研究院；去芹糖桔梗皂苷E对照品(批号：PRF8032746，CAS号：849758-42-5，纯度：98.5%)来源于成都普瑞法科技开发有限公司；桔梗皂苷E对照品(批号：18030721，CAS号：237068-41-6，纯度：98.5%)、桔梗皂苷D3对照品(批号：18050126，CAS号：67884-03-1，纯度：98.6%)均来源于上海同田生物技术股份有限公司。

小儿止嗽金丹(承德新爱民制药有限公司，规格：每袋装0.6 g，批号分别为：180906、190201、190302、190310、190313；山西正元盛邦制药有限公司，批号分别为：180714、181014、181023、181130、181204)；乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 精密称取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，加60%甲醇溶解并制成每1 mL含苦杏仁苷4.318 mg、去芹糖桔梗皂苷E 0.156 mg、桔梗皂苷E 0.332 mg、桔梗皂苷D30.128 mg、哈巴苷0.972 mg、哈巴俄苷0.354 mg的单成分对照品储备液。再精密吸取上述储备液2.5 mL，置50 mL量瓶中，用60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液 取小儿止嗽金丹适量，混匀，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，称定质量，超声处理45 min，放冷至室温，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3阴性样品溶液 按照小儿止嗽金丹的工艺处方，制备缺炒杏仁、缺桔梗和缺玄参的阴性样品，再按2.1.2项下方法制备3种阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～12.0 min，6.0%A；12.0～20.0 min，6.0%～10.0%A；20.0～37.0 min，10.0%～32.0%A；37.0～52.0 min，32.0%～58.0%A；52.0～60.0 min，58.0%～6.0%A)；检测波长：210 nm[2-6]；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：室温；进样量：10 μL。

2.3 系统适应性试验

精密吸取2.1.1项下的混合对照品溶液及2.1.2、2.1.3项下制备的溶液各适量，依法进样测定，结果测定成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按所测定成分色谱峰计均不低于4500，阴性样品无干扰，色谱图见图 1。

注：A.混合对照品；B.小儿止嗽金丹；C.炒杏仁阴性样品；D.桔梗阴性样品；E玄参阴性样品；1.苦杏仁苷；2.去芹糖桔梗皂苷E；3.桔梗皂苷E；4.桔梗皂苷D3；5.哈巴苷；6.哈巴俄苷。图1 混合对照品、小儿止嗽金丹、炒杏仁阴性样品、桔梗阴性样品和玄参阴性样品HPLC图

2.4 QAMS方法学考察

2.4.1线性范围考察 分别精密吸取2.1.1项下单成分对照品储备液2.0 mL，置于20 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅰ，再依次精密吸取混合对照品溶液Ⅰ各适量，依次用60%甲醇稀释2、4、8、16、20倍，制成混合对照品溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ，依次精密吸取混合对照品溶液Ⅵ～Ⅰ各适量，进样检测，记录色谱图，以所测各成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

2.4.2精密度试验 精密吸取混合对照品溶液适量，在2.2项色谱条件下重复进样6次，记录苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的峰面积，结果这6个成分峰面积的RSD分别为0.63%、1.06%、1.17%、1.30%、0.86%和1.25%。

2.4.3重复性试验 取同一批次小儿止嗽金丹样品适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，再按2.2项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的含量，结果所测成分含量的RSD分别为1.07%、1.77%、1.59%、0.93%、1.24%和1.66%。

表1 小儿止嗽金丹6个成分线性关系结果

2.4.4稳定性试验 精密称取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷6个对照品各适量，制成混合对照品溶液，分别于制备后0、2、4、6、12、16、24 h进样检测，结果苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷对照品峰面积的RSD分别为0.69%、1.10%、1.21%、1.28%、0.78%和1.32%；取同一批次小儿止嗽金丹供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、12、16、24 h进样检测，结果供试品溶液中苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.83%、0.98%、1.20%、1.37%、0.74%和1.29%，表明混合对照品溶液和小儿止嗽金丹供试品溶液室温下24 h内稳定。

2.4.5加样回收率试验 取已知含量的小儿止嗽金丹适量，混匀，取9份，每份0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入加标对照品溶液(苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷质量浓度分别为1.276、0.048、0.086、0.034、0.296、0.092 mg·mL-1)各1.0 mL(3份)、2.0 mL(3份)、3.0 mL(3份)，按照2.1.2项下的方法制备加样样品溶液，按2.2项下色谱条件依次进样检测，结果所测成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的平均加样回收率分别为99.85%、97.88%、98.10%、96.95%、100.13%、98.66%，RSD分别为0.69%、1.41%、1.51%、1.06%、0.73%、0.89%(n=9)。

2.5 相对校正因子的计算

2.5.1相对校正因子的测定 在2.2项色谱条件下，取2.4.1项下制备的混合对照品溶液Ⅵ～Ⅰ，依法进样测定，记录色谱峰峰面积。以哈巴苷为内参物，按公式(1)计算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的相对校正因子，结果见表2。

内/待=内/待=(A内c待)/(A待c内)

(1)

式中A内为内参物哈巴苷的峰面积，c内为内参物哈巴苷的质量浓度，A待为待测成分的峰面积，c待为待测成分的质量浓度。

2.5.2待测组分色谱峰的定位 采用相对保留时间法对待测成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷色谱峰进行定位，以内参物哈巴苷色谱峰为基准峰，考察2个品牌的高效液相色谱仪：LC-2010C型及UltiMate3000型和3种色谱柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsi C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)条件下，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷与哈巴苷的相对保留时间值，结果见表3。

2.5.3不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 考察了2个品牌的高效液相色谱仪：LC-2010C型及UltiMate3000型和3种色谱柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsi C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)对相对校正因子值的影响，结果见表4。由表4可知，不同品牌检测仪器和不同色谱柱对相对校正因子值无显著影响。

表2 以哈巴苷为内参物的5个成分的f值

表3 小儿止嗽金丹6个成分相对保留时间

表4 不同色谱仪和不同色谱柱对f值的影响

2.5.4不同流速对相对校正因子的影响 分别考察了不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)对相对校正因子值的影响，结果见表5。

2.6 一测多评法与外标法的比较

取10个批次的小儿止嗽金丹样品适量，按照2.1.2项下方法制备样品溶液，每个批次平行制备3份，在2.2项色谱条件下，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用外标法计算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的含量；并根据苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的相对校正因子值，计算苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴俄苷的含量。比较一测多评法与外标法所测结果，2种方法所测结果的偏差(RAD)均小于2.0%，表明一测多评法用于小儿止嗽金丹的多指标成分质量评价研究是可行的，测定结果见表6。

表5 不同流速对f值的影响

表6 小儿止嗽金丹6种成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

注：ESM为外标法；QAMS为一测多评法。

3 讨论

3.1 待测指标成分的选择

小儿止嗽金丹由炒杏仁、桔梗、玄参、知母、麦冬、竹茹、炒紫苏子等15味中药组方而成，方中玄参、麦冬清热润肺、滋阴生津，为方中君药；胆南星(酒蒸)、竹茹、川贝母、天花粉、知母清热化痰，杏仁(炒)、紫苏子(炒)、瓜蒌子止咳平喘，为方中臣药；佐以紫苏叶解表散寒，桔梗宣肺利咽，桑白皮泻肺平喘，槟榔(炒)消积行气；甘草祛痰止咳，调和诸药，为方中使药，诸药合奏，共达解热润肺、化痰止嗽的功效。参考中药质量标志物的确定原则，选取小儿止嗽金丹方中君药玄参所含标志性成分哈巴苷、哈巴俄苷，臣药炒杏仁所含代表性成分苦杏仁苷以及佐药桔梗所含主要成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3为定量测定指标，采用一测多评法实现对小儿止嗽金丹中多组分的同时测定。

3.2 色谱条件的考察

分别以乙腈-水系统[4]和甲醇-水系统为流动相，试验结果发现，以甲醇-水为流动相时，个别峰峰形不好，有拖尾现象，分离效果不好；乙腈-水为流动相进行分析时，部分峰有拖尾现象，为使峰变得尖锐，考虑向水相中加入适量浓度的磷酸溶液[2，5-7]，通过对磷酸溶液浓度及流动相比例的不断摸索，最终确定以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，按照文中2.2项下梯度洗脱比例对小儿止嗽金丹中所含苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷进行同时测定，在此条件下，待测成分色谱峰峰形尖锐，各组分间的分离度符合要求。

本实验建立的一测多评方法，实现了对小儿止嗽金丹所含主要成分苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、哈巴苷、哈巴俄苷的同时测定，所建立的方法操作简单，准确度高，为评价小儿止嗽金丹的内在质量提供了参考。