花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析

巩雪芳, 杨 平, 王延来, 郭 莉, 陈 迪, 谢寿安, 吕淑杰

(西北农林科技大学林学院, 陕西杨凌 712100)

昆虫在其长期进化过程中，依靠着灵敏的嗅觉系统来生存和适应环境变化(王桂荣等, 2002)，在其交配、产卵、对寄主植物定位和选择等行为中，嗅觉器官均发挥着至关重要的作用(王超群等, 2017; 陈东凯等, 2018)。昆虫在其嗅觉感受信息物质的过程中，形成了多种分布形式不一，执行着不同功能的嗅觉相关蛋白，它们通过各自的分工与合作组成了精密复杂的嗅觉系统，进而共同来调节昆虫嗅觉和其他生理活动(孙可可, 2018)。这些嗅觉相关蛋白主要包括气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、气味受体(odorant receptors, ORs)、离子型受体(ionotropic receptors, IRs)、感受神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)和气味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)等(胡颖颖等, 2013; 詹文会等, 2018)。在昆虫嗅觉感受的过程中，OBP 选择性地与某些特定类型的气味分子相结合，起到过滤器的作用(Pelosi and Maida, 1995)。花椒窄吉丁Agriluszanthoxylumi为鞘翅目(Coleoptera)吉丁虫科(Buprestidae)窄吉丁属Agrilus，广泛分布于我国北方的花椒产区，包括陕西、甘肃、山东、山西等地(党国刚等, 2017)。幼虫主要是通过取食韧皮部后逐渐开始蛀食形成层，受害部位症状表现为虫疤松软湿润，椒农称之为“流油” (焦浩, 2011; 李辉, 2013)。成虫通过取食叶片补充营养，造成叶片缺刻、空洞，树皮大量流胶、软化、腐烂干枯、龟裂最后脱落甚至整株死亡(高焕婷和张国龙, 2007; 杜平, 2012; 王燕等, 2012)。近年来，在花椒产业的发展过程中构成了巨大威胁，给椒农带来了严重的经济损失(权丽君, 2016)。因此，如何更有效、更环保地防治花椒窄吉丁已引起广大椒农和病虫害防治部门的高度重视。

OBP 最早发现于鳞翅目昆虫，之后在鞘翅目、膜翅目、同翅目、双翅目等昆虫中也相继被发现(李正西和Zhou JJ, 2004; Wangetal., 2013; 宋月芹等, 2014)。迄今为止，OBPs 已在斜纹夜蛾Spodopteralitura、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis、绿盲蝽Apolyguslucorum、松墨天牛Monochamusalternatus、云斑天牛Batoceralineolata、椰甲截脉姬小蜂Asecodeshispinarum、白背飞虱Sogatellafurcifera、烟粉虱Bemisiatabaci、梨小食心虫Grapholitamolesta、大草蛉Chrysopapallens、中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、茶尺蠖Ectropisobliqua和柑橘大实蝇Bactroceraminax(金丰良等, 2008; 程晓东等, 2011; Huangetal., 2013; 梁庆梅, 2014; Li Ketal., 2015; Li ZQetal., 2015; 钱凯等, 2015; Cuietal., 2016; 蒋艳东等, 2016; 王然等, 2016; 张国辉和仵军祥, 2016; 卓志航等, 2016; 冯一璐等, 2017; 司品法等, 2018)等近100种昆虫中被报道。OBPs是一类可溶性的小分子量亲和球蛋白，相对分子量约为15～17 kD，氨基酸的数量为120～160个，等电点为4.4～5.2(Briandetal., 2001)。N末端有一段20个氨基酸左右的信号肽，序列中具有6个保守的半胱氨酸位点(Pelosietal., 2006; Steinbrecht, 2010)；二级结构由α-螺旋、LOOP环所形成的二硫键组成，在其三级结构中起到了支撑作用(Vogt and Riddiford, 1981; Scalonietal., 1999; Dambergeretal., 2007; Jacquinjolyetal., 2010)。目前国内对花椒窄吉丁的研究主要集中于化学防治和生物学特性方面(刘绥鹏等, 2016; 袁丽芳等, 2016)，国外几乎无相关研究报道，但是化学防治方法具有难奏效、农药残留、污染环境等弊端。近几年，本实验室已对花椒窄吉丁的寄主植物花椒挥发物的组成进行了鉴定(袁丽芳等, 2016)，初步获得了对成虫有电生理活性和行为活性的组分(刘绥鹏, 2017)；同时也对花椒窄吉丁成虫后肠和粪便提取物中的挥发性物质、成虫的电生理活性和行为活性做了测定(刘绥鹏等, 2016)。但是，对其气味结合蛋白及气味物质与寄主挥发物的结合机理研究还处于空白。因而探究花椒窄吉丁气味结合蛋白的理化特性与结构对其明确功能和作用机理就显得至关重要。

本研究通过实验室前期构建的花椒窄吉丁雌雄成虫触角转录组数据进行相关的生物信息学分析，通过BLAST同源比对的方法分析鉴定出了与花椒窄吉丁化学感受相关的气味结合蛋白基因AzanOBP3，利用在线软件分析预测AzanOBP3基因的理化特性和结构，将其氨基酸序列与其他的已研究发表过的鞘翅目昆虫气味结合蛋白氨基酸序列比对，通过构建系统发育进化树的方法，进行亲缘关系初步推断与分析。通过RT-PCR技术首次克隆鉴定花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3，通过酶切重组的方法将扩增产物插入pET-28a(+)载体构建重组表达载体，转化感受态细胞进行了表达；并采用qPCR技术分析了AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织中的表达情况，期望本研究结果为今后继续开展其配基结合特性研究并应用于农林害虫的绿色防控技术诱芯的筛选与制备奠定基础，为农林业鞘翅目蛀干害虫在搜寻寄主、吸引配偶、寻找产卵场所等行为活动领域的研究提供重要的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫的采集与样品收集

2018年5-7月于陕西省西安市蓝田县普化镇周董村的花椒园采集花椒窄吉丁成虫。提取 RNA 前选取 1 000头活动能力较强的成虫，解剖镜下分别切下雌雄成虫触角，液氮冷冻并保存于-80℃低温冰箱中备用。

1.2 总RNA的提取与cDNA第1链的合成

采用Trizol法(Trizol, Invitrogen)提取花椒窄吉丁成虫触角以及雌雄成虫头、胸、腹、足和翅总RNA，具体步骤依据Invitrogen说明书进行。总RNA的质量1%琼脂糖凝胶电泳检测；根据NanaDrop2000紫外可见光分光光度计检测RNA样品的完整性和浓度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(Thermo)合成cDNA第1链备用。

1.3 花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆

以1.2节中合成的花椒窄吉丁雌雄成虫触角cDNA作为模板，根据花椒窄吉丁成虫触角转录组测序注释到的候选OBP3基因设计1对特异性引物(表1)，进行目的基因PCR克隆。PCR反应体系: cDNA模板<1 μg, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 2×Reaction Mix 12.5 μL, ddH2O补至25 μL。扩增程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃延伸5 min。扩增产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞，最后将鉴定的阳性克隆菌株送北京奥科生物有限公司进行测序。

表1 实验中所用引物Table 1 Primers used in the experiment

下划线序列分别表示内切酶BamHⅠ (GGATCC) 和XhoⅠ (CTCGAG) 酶切位点。雌成虫内参基因用Actin，雄成虫内参基因用28S-2。Restriction sites ofBamHⅠ (GGATCC) andXhoⅠ (CTCGAG) are underlined, respectively. The reference gene used for female adult isActinand for male is28S-2.

1.4 生物信息学分析

利用在线程序Expasy 对目的基因序列进行翻译(http: ∥expasy.org/translate/)，预测其蛋白分子量、等电点及其他的理化特性(http:∥expasy.org/protparam/)；Open Reading Frame Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测其开放阅读框；SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 预测其信号肽，通过NCBI中的BLAST进行氨基酸序列的同源比对。在花椒窄吉丁AzanOBP3与其他昆虫 OBPs 的系统发育进化树构建中，先采用 Clustalx1.83 进行多序列比对，然后利用MEGA5.0 软件并采用最大似然法(maximum likelihood, ML) (Bootstrap:1 000次)来构建进化树分析亲缘关系的远近。

1.5 构建原核表达载体及IPTG诱导融合蛋白表达

根据花椒窄吉丁OBP3的编码序列及表达载体pET-28a(+)设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物序列(表1)。以雌雄成虫触角cDNA为模板进行PCR扩增(Golden Easy PCR System)。PCR反应体系(25 μL): cDNA模板<1 μg, 正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL, 2×Reaction Mix 12.5 μL, ddH2O补至25 μL。扩增程序: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s， 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min， 30个循环；72℃延伸5min。将扩增产物纯化回收(QIA QuickR Gel Extraction Kit, QIAGEN)后连接到pMD18-T克隆载体(TaKaRa, Clontech)中，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑取阳性菌落振荡培养12～16 h (37℃, 220 r/min)，提取质粒[Plasmid Mini Kit I (OMEGA)试剂盒] DNA并测序验证(北京奥科生物有限公司测序)。 将含有目的片段的重组克隆质粒DNA和pET-28a(+)质粒DNA分别进行酶切，在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段连接到表达载体pET-28a(+)上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含有卡那霉素(Kan)的LB平板培养基进行筛选，挑取阳性克隆进行培养，小量提取质粒后测序验证。将测序验证正确的重组质粒pET-28a/AzanOBP3转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单菌落于LB培养液中振荡培养(37℃ 220 r/min, 12～16 h)，将小量培养后的菌液按1∶100(v/v)的比例接种于新鲜的LB培养液(含Kan 50 μg/mL)中，37℃ 220 r/min振荡培养至OD600=0.6～0.8时，加入终浓度1 mmol/L IPTG诱导培养4 h，然后离心收集菌体，将菌体重新悬浮后超声波破碎，12 000 r/min离心30 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。

1.6 融合蛋白的Western blot检测

将PVDF膜和滤纸分别裁剪成与凝胶相同的大小，使用转膜缓冲液处理后，按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪的电极板之间，开始转膜。设置转膜仪参数：电流(62 mA)、转印时间(80 min)，将PVDF膜置于含1.5% BSA的10 mL Blocking Buffer中，4℃平放过夜封闭。使用稀释后的Penta-His Antibody溶液6 mL，进行一次抗体反应1 h。TBST缓冲液(20 mL)洗涤2次；洗涤TBST缓冲液漂洗 3次，每次5 min。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液6 mL，进行二次抗体反应1 h。TBST缓冲液(20 mL)洗涤 2次；洗涤TBST缓冲液冲洗3次。滴1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate显色1 min；10 mL Western BrightTMECL显色5 min，在暗室中进行曝光显色反应。

1.7 qPCR检测AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫各组织中的表达谱

根据花椒窄吉丁气味结合蛋白编码基因全长序列设计qPCR引物(表1)，研究AzanOBP3基因在不同组织部位中的表达情况，雌成虫内参基因用Actin，雄成虫内参基因用28S-2，qPCR所用的引物序列见表1。以1.2节合成的花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织的cDNA第1链为模板，PCR反应体系(20 μL): 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板1.0 μL, 补充ddH2O到20 μL混匀(试剂盒为Vazyme ChamQTMSYBR®qPCR Master MixQ311-02/03)。扩增程序: 95℃预变性10 min; 95℃变性10 s, 95℃30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环，之后从65～95℃之间进行熔解曲线分析以排除非特异性PCR产物的污染，每个样品3次生物学重复，3次技术重复。

1.8 数据分析

采用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪相应软件进行数据分析，EXCEL整理数据。相对定量采用2-△△Ct法计算OBP3在不同组织的相对表达量，采用Duncan氏多重比较检验法比较分析花椒窄吉丁成虫不同组织中目的基因表达量的差异显著性，采用独立样本T检验(independent samplest-test)检测雌雄成虫同一组织中的基因表达量的差异显著性。

2 结果

2.1 花椒窄吉丁AzanOBP3基因的克隆和序列分析

PCR同源克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白编码基因片段大小符合预期结果。AzanOBP3基因cDNA全长614 bp(GenBank登录号: MT318832)，上游有起始密码子ATG，下游有终止密码子TGA，包括一个414 bp的开放阅读框(ORF)，编码137个氨基酸残基，其5′和3′端分别有35 bp和142 bp的非编码区。在线预测到成熟蛋白分子量为16.038 kD，理论等电点为4.79，而且该蛋白氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸(C1, C2, C3, C4, C5和C6)(图1)，符合典型气味结合蛋白家族特征。

图1 花椒窄吉丁AzanOBP3核苷酸序列及其推导氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of AzanOBP3 fromAgrilus zanthoxylumi保守位点上的半胱氨酸用红色方框表示，信号肽用单下划线表示。The conserved cysteines are indicated in red box, and the predicted signal peptide is underlined.

花椒窄吉丁AzanOBP3 N端前29位氨基酸为信号肽，在第29和30位氨基酸之间存在一个信号肽切割位点，该特征符合分泌蛋白特征。AzanOBP3有多个比较明显的疏水区，可能是亲脂性的气味分子的结合位点，该蛋白上有较少的区域能够结合脂类气味分子，有亲脂性的氨基酸即可能与疏水性的气味物质结合，又有可能与亲水性的物质结合，有较多数量的亲水性氨基酸，暗示该蛋白可能是一种能够与水亲和的球蛋白。AzanOBP3第1-137位氨基酸均位于细胞膜表面，预测蛋白AzanOBP3不包含跨膜螺旋，这与该蛋白的疏水性区域分析结果基本一致，表明AzanOBP3具一个有细胞信号传导功能的膜受体蛋白。通过SOPMA工具预测到花椒窄吉丁AzanOBP3的二级结构是由56.93%的α-螺旋、7.3%的延伸链、3.65%的 β-转角和32.12%的无规则卷曲组成。

2.2 花椒窄吉丁AzanOBP3序列比对和系统进化发育分析

将AzanOBP3的氨基酸序列与已报道的鞘翅目其他几种昆虫的OBPs进行多重联配(图2)，发现每种昆虫OBP氨基酸序列中均有6个保守的半胱氨酸位点，且分布符合C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6和C1-X15-39-C2-X3-C3-X21-44-C4-X7-42-C5-X8-C6(X为除半胱氨酸以外的其他氨基酸)的典型特征。通过对AzanOBP3序列同源性搜索(BLASTX)发现，AzanOBP3与苹果小吉丁Agrilusmail和白蜡窄吉丁AgrilusplanipennisOBP的氨基酸序列一致性最高，分别达74.45%和76.92%，表明它们之间在进化关系上更加同源，与已知其他昆虫的OBPs的氨基酸序列一致性较低，均小于50%。

图2 AzanOBP3与其他昆虫OBPs氨基酸序列比对Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of AzanOBP3 with OBPs from other insectsOBPs来源物种及GenBank登录号Source species of OBPs and their GenBank accession numbers: AzanOBP3: 花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi(MT318832); AmalOBP2: 苹果小吉丁Agrilus mail (MF615491.1); AplaGOBP: 白蜡窄吉丁Agrilus planipennis (XP_025829930.1); DhelOBP13: 花绒寄甲Dastarcus helophoroides (AIX97059.1); DarmOBP2: 华山松大小蠹Dendroctonus armandi (AIY61045.1); DponOBP: 中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae (AFI45061.1); DponOBP3: 中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae (AKK25131.1); PaenOBP15: 榆蓝萤叶甲Pyrrhalta aenescens (APC94288.1); PmacOBP15: 榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis (APC94206.1); CbowOBP17: 大猿叶甲Colaphellus bowringi (ALR72505.1); TcasOBP25: 赤拟谷盗Tribolium castaneum (EFA04747.2); TmolOBP2: 黄粉虫Tenebrio molitor (AJM71476.1); AchiOBP: 星天牛Anoplophora chinensis (AUF72991.1); AglaGOBP: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (XP_023310142.1). 图3同The same for Fig. 3. 红色星号表示保守位点上的半胱氨酸。绿色区域表示包含普通气味结合蛋白在内的所有气味结合蛋白结构中的相同保守结构域位点。紫色表示所有气味结合蛋白结构中相同的氨基酸。Conserved cysteines are indicated with the red asterisk. The green region represents the same conserved domain site in all odorant binding protein structures including the common odorant binding protein. Purple region indicates the same amino acid in all odorant binding protein structures.

花椒窄吉丁气味结合蛋白AzanOBP3的氨基酸序列与已报道的鞘翅目其他昆虫如苹果小吉丁Agrilusmail的AmaiOBP2, 白蜡窄吉丁Agrilusplanipennis的AplaGOBP, 花绒寄甲Dastarcushelophoroides的DhelOBP13, 华山松大小蠹Dendroctonusarmandi的DarmOBP2, 中欧山松大小蠹Dendroctonusponderosae的 DponOBP3, 榆蓝萤叶甲Pyrrhaltaaenescens的PaenOBP15, 榆黄毛萤叶甲Pyrrhaltamaculicollis的PmacOBP15, 大猿叶甲Colaphellusbowringi的CbowOBP17, 星天牛Anoplophorachinensis的AchiOBP, 光肩星天牛Anoplophoraglabripennis的AglaGOBP, 模式昆虫赤拟谷盗Triboliumcastaneum的TcasOBP25和黄粉虫Tenebriomolitor的TmolOBP2的氨基酸序列的系统发育树发现，AzanOBP3与苹果小吉丁的AmalOBP2和白蜡窄吉丁的AplaGOBP相似度最高，氨基酸序列一致性达到了100%，这说明气味结合蛋白在这几种昆虫间的亲缘关系较近(图3)。

图3 基于花椒窄吉丁AzanOBP3和其他昆虫OBP蛋白氨基酸序列的系统进化树分析(最大似然法)Fig. 3 Phylogenetic tree of AzanOBP3 from Agrilus zanthoxylumi and OBPs from other insectsbased on the amino acid sequences (maximum likelihood method)

2.3 AzanOBP3的原核表达及Western blot检测

成功构建了pET-28a(+)/AzanOBP3原核表达载体，37℃ 180 r/min摇床培养至OD600值约为 0.6 时添加 150 mmol/L IPTG 33 μL(终浓度为 1 mmol/L IPTG)进行诱导表达，37℃培养4 h。取变性后的样品10 μL 进行上样，SDS-PAGE结果如图4(A)所示，在大肠杆菌中成功地表达出了与预测蛋白分子质量大小一致的AzanOBP3融合蛋白。通过对重组蛋白纯化后样品进行Western blot分析，结果显示在样品相应位置有明显信号，且检测到His-Tag标签蛋白，显色后的PVDF膜如图所示(4: B)。

图4 重组蛋白AzanOBP3的SDS-PAGE检测(A)和Western blot(B)分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis (A) and Western blotting (B) of recombinant protein AzanOBP3M1, M2: 蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker (Broad); 1: IPTG诱导前全蛋白Whole protein before IPTG induction; 2: IPTG诱导前上清Supernatant before IPTG induction; 3: IPTG诱导前沉淀Precipitate before IPTG induction; 4: 经IPTG诱导后的全蛋白Whole protein after induction with IPTG; 5: 经IPTG诱导后的上清Supernatant after induction with IPTG; 6: 经IPTG诱导后的沉淀Precipitate after induction with IPTG; 7: IPTG诱导前全蛋白Whole protein before IPTG induction; 8: IPTG诱导前上清Supernatant before IPTG induction; 9: IPTG诱导前沉淀Precipitate before IPTG induction; 10: IPTG诱导后的全蛋白Whole protein after induction with IPTG; 11: IPTG诱导后的上清Supernatant after induction with IPTG; 12: IPTG诱导后的沉淀Precipitate after induction with IPTG.

2.4 AzanOBP3在花椒窄吉丁成虫不同组织中的表达量

根据2-△△Ct相对定量法，以雄成虫足中的表达量为基准，测定AzanOBP3在花椒窄吉丁成虫不同组织中的表达谱。结果表明(图5)，AzanOBP3在雌雄虫头、胸部、腹部、足、翅中均有表达，且表达量不一，在雄成虫各组织的表达量为：足>胸部>头部>翅>腹部；在雌成虫不同组织中表达量为：头>腹部>足>翅>胸部。AzanOBP3在雌雄成虫间各组织(除足部)中的表达量差异不显著(P>0.05)，仅在足中雄成虫的表达量显著高于雌成虫(P=0.0227);但除腹部以外，雄成虫各组织中的表达量均较雌虫的要高些。

图5 AzanOBP3在花椒窄吉丁成虫各组织中的表达量分析Fig. 5 Expression profile of AzanOBP3 in various tissues of Agrilus zanthoxylumi adults图中数据为平均值±标准差；柱上不同小写字母和大写字母分别表示雌成虫和雄成虫不同组织间的表达量差异显著(P<0.05, Duncan氏多重检验)；柱上星号示雌雄成虫同一组织中的表达量差异显著(P<0.05, t检验)。Data in the figure are mean±SD. Different lowercase and capital letters above bars indicate significantly different gene expression levels among different tissues of female and male adult, respectively (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level in the same tissue between female and male adults (P<0.05, t-test)

3 讨论

昆虫的触角对于信息素的聚集、寄主和非寄主挥发性物质的特异性识别起着至关重要的作用(Huangetal., 2013; Zhangetal., 2015)。本研究是基于花椒窄吉丁成虫触角转录组测序所获得的序列数据基础，通过预测其开放阅读框和氨基酸序列的方法，成功克隆得到了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3开放阅读框的全长序列。序列分析表明，AzanOBP3基因编码的氨基酸序列具有6个保守的半胱氨酸残基，编码137个氨基酸组成的多肽，在第 29-30位氨基酸存在一个信号肽切割点，预测的蛋白分子量为16.038 kD，等电点(pI)为4.79。

将AzanOBP3的氨基酸序列与其他几种已报道的鞘翅目昆虫气味结合蛋白进行多重联配，发现每个昆虫气味结合蛋白氨基酸序列中均有6个保守的半胱氨酸位点，AzanOBP3与苹果小吉丁的AmalOBP2和白蜡窄吉丁的AplaGOBP的同源性最高，氨基酸序列一致性分别达74.45%和76.92%，表明它们之间在进化关系上更加同源。理化特性分析发现，AzanOBP3具有多个比较明显的疏水区，有较少的区域能够结合脂类气味分子，有亲脂性的氨基酸即可能与疏水性的气味物质结合，又有可能会与亲水性的物质结合。昆虫OBPs是一类水溶性小分子量酸性蛋白，其典型特征是在二级结构中存在6个保守的半胱氨酸, 分别交叉形成3个二硫键，因此对其三维结构起到支撑作用(Briandetal., 2001)，AzanOBP3的二级结构由56.93%的α-螺旋、7.3%的延伸链、3.65%的 β-转角和32.12%的无规则卷曲组成。

气味结合蛋白作为载体，负责筛选、结合以及运输疏水性气味分子到达特异性气味受体，是昆虫感知外界环境的基础(Vogt and Riddiford, 1981; Steinbrechtetal., 1995)，能够与特定的气味分子相结合，推测具有选择气味的功能，是昆虫了解外界环境的首当其冲的反应(黄恩炯等, 2008; 钟涛等, 2008; Zhouetal., 2009; 张升祥等, 2010; Pelletier and Leal, 2011; 李慧等, 2018)。本研究对AzanOBP3在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织中的相对表达量进行了比较分析，结果表明AzanOBP3在雄成虫足中的表达量最高，推测雄虫对气味结合的能力要强于雌虫，且AzanOBP3的功能可能不仅局限于嗅觉识别。经原核表达发现，融合蛋白在总蛋白中表达量较大，而在可溶性蛋白部分表达量相对较少，且 SDS-PAGE中的表观分子量比预测的分子量偏大，猜测造成融合蛋白His-AzanOBP3表观分子量偏差的原因可能是His 标签(唐威华等, 2000)，至于该猜测是否准确还需进行蛋白纯化后切去蛋白标签后SDS-PAGE检测验证，以便为今后配基结合特性的研究提供良好的融合蛋白。

组织表达谱分析发现，AzanOBP3在雄成虫足中的表达量最高，提示AzanOBP3不仅在成虫的嗅觉识别中发挥着重要的作用，在花椒窄吉丁成虫非嗅觉组织中可能也具有重要的生理功能，同时也可能与雄性成虫寻求配偶的选择性有关联。AzanOBP3是首次报道的花椒窄吉丁的OBP基因，对本实验已克隆的AzanOBP3基因，将由本实验室继续进行表达纯化其蛋白，通过荧光竞争结合等实验明确该气味结合蛋白的结合谱，为探讨该蛋白分子结构及其在花椒窄吉丁成虫触角感受化学信息物质的作用机理提供依据，为今后高效开发和设计花椒窄吉丁生物信息素的绿色防控引诱剂的筛选奠定基础。