利用单感器记录与神经元示踪结合对棉铃虫主要性信息素感器内神经元投射的鉴定

马百伟, 刘晓岚, 常亚军, 谢桂英, 陈文波,刘 杨, 赵新成,*, 王桂荣,*

(1. 河南农业大学植物保护学院, 郑州 450002;2. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

触角是昆虫重要的感觉器官，具有嗅觉感器、味觉感器和机械感器等多种类型的感器，其中嗅觉感器为主要感器(Chapman, 2013)。嗅觉受体神经元(olfactory receptor neuron, ORN)位于嗅觉感器内，其树突膜上表达有特定的气味受体，可以感受某种或某类气味分子(Leal, 2013)。嗅觉受体神经元的轴突投射进入昆虫脑内的嗅觉初级中枢触角叶(antennal lobe)，从而能够将外界的气味信息从外周神经传递到脑中枢(Hildbrand and Shepherd, 1997; Wilson and Mainen, 2006)。触角叶是嗅觉信息重要处理中心，由许多神经纤维球(glomerulus)构成(Hildbrand and Shepherd, 1997; 赵新成等, 2015)。在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中已经证明，表达同一种气味受体的嗅觉受体神经元的轴突汇聚到同一个神经纤维球中，即遵循“1种受体-1种受体神经元-1个神经纤维球”的原则(Vosshalletal., 2000; Coutoetal., 2005; 赵新成等, 2015)。这是触角叶对气味信息进行编码整合的前提，所以研究嗅觉受体神经元的功能及其投射的神经纤维球对理解触角叶的信息编码机制具有重要意义。对于黑腹果蝇而言，研究人员可以通过电生理技术和遗传标记来明确其触角上嗅觉感器内嗅觉受体神经元的功能及其投射的神经纤维球(Coutoetal., 2005; Fishilevichetal., 2005)。对于普通昆虫而言，目前尚无法达到这一水平。但是，单感器记录与神经元示踪技术相结合的方法，为研究普通昆虫的感器内嗅觉受体神经元的功能及其投射的神经纤维球提供了技术支持。

目前，该方法已被应用于多种蛾类昆虫，鉴定性信息素嗅觉受体神经元及其投射的神经纤维球，如黄地老虎Agrotissegetum(Hanssonetal., 1992)、烟芽夜蛾Heliothisvirescens(Hanssonetal., 1995; Bergetal., 1998)、烟青虫Helicoverpaassulta(Bergetal., 2005)、美洲棉铃虫Helicoverpazea(Leeetal., 2006a)和Heliothissubflexa(Leeetal., 2006b)等(表1)。这些研究中均发现长毛形感器内感受不同性信息素组分的嗅觉受体神经元轴突投射进入雄性特异的扩大型神经纤维球复合体(macroglomerular complex, MGC)中不同的神经纤维球内。在这些研究中，主要是使用赖氨酸钴进行染色标记神经元。然而，赖氨酸钴标记的神经元成像则需要对脑组织进行切片处理，然后利用普通光学显微镜将切片成像。一方面，昆虫脑组织切片操作难度较大，易损坏样品，另一方面，后期图像的三维重建分析不方便，无法呈现神经元三维空间的分布模式(表1)。近几年来，生物素偶联的葡聚糖四甲基罗丹明(dextran tetramethyl rhodamine with biotin)被广泛应用到昆虫神经元的染色标记，荧光染色标记的神经元无需切片处理，可直接放置于激光共聚焦显微镜进行连续多层扫描成像，利于后续三维空间分析(Nishinoetal., 2009; Zhao and Berg, 2010)。该染料同时具有两种示踪剂：第1种是四甲基罗丹明共轭右旋糖酐，本身具有荧光基团；第2种是神经生物素，在第1种示踪剂的荧光猝灭后，还可以利用神经生物素荧光探针进行第2次荧光标记(Zhao and Berg, 2010)。

棉铃虫Helicoverpaarmigera是我国重要的农业害虫，研究棉铃虫嗅觉感受的神经机制，可为进一步研发棉铃虫引诱剂技术提供基础理论知识。近几年，关于棉铃虫气味感受机制，尤其在性信息素感受机制方面的研究，获得突飞猛进的发展。通过利用转录组分析、蛙卵表达系统和电压钳等技术明确了性信息素及其类似物的受体(Liuetal., 2013; Jiangetal., 2014; Changetal., 2016, 2017; Yangetal., 2017)。 利用单感器记录技术，发现了棉铃虫触角感受性信息素及其类似物的A, B和C 3种类型感器(Wuetal., 2013; Changetal., 2016; Xuetal., 2016)。利用钙离子成像技术研究表明了棉铃虫触角叶MGC是负责接收性信息素及其类似物的初级中心(Wuetal., 2013; Xuetal., 2016)。这些在受体、感器和神经纤维球水平上取得的重要进展，为进一步在神经元水平研究棉铃虫气味信息感受机制奠定了基础。在本研究中，我们将使用荧光染料Micro-ruby，即生物素偶联的葡聚糖四甲基罗丹明作为示踪剂，同单感器记录相结合鉴定棉铃虫的触角嗅觉受体神经元的功能和形态及其投射的神经纤维球。

表1 蛾类昆虫单感器记录与神经元示踪应用Table 1 Applications of single sensillum recording and staining in moths

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

棉铃虫由本试验室人工饲养，饲养温度为27±1℃，相对湿度为65%±5%，光周期为14L∶10D。成虫喂以10%(m/v)浓度的蔗糖水溶液，羽化后3-4 d的未交配雄性成虫用于试验。

1.2 气味物质

试验使用的气味物质为棉铃虫性信息素及其类似物化合物，包括顺-11-十六碳烯醛(Z11-16:Ald, CAS: 53939-28-9)、顺-11-十六碳烯醛(Z9-16:Ald, CAS: 56219-04-6)、顺-11-十六碳烯醛(Z9-14:Ald, CAS: 53939-27-8)、顺-11-十六碳烯醛(Z11-16:OH, CAS: 56683-54-6)和顺-11-十六碳烯醛(Z11-16:Ac, CAS: 34010-21-4)，均为人工合成化合物，购于常州宁录生物科技有限公司，纯度均≥96%。溶剂为正己烷(CAS:110-54-3, Sigma-Aldrich Inc)。

1.3 单感器记录与神经元示踪

本研究采用切割感器顶端记录法来记录长毛形感器的功能(Kaissling, 1974)。把雄性棉铃虫装入1 mL的塑料枪头内，固定虫体头部和触角基部，之后用双面胶将触角轻轻地固定在盖玻片上(图1)。在体视显微镜下，将玻璃电极末端切成斜口并在尖端灌注4%生物素偶联的葡聚糖四甲基罗丹明(Micro-ruby, 3000 MW, D7156, Invitrogen)示踪剂溶液作为记录电极。利用微动操作仪(Leica, Bensheim, 德国)将记录电极套在感器末端，参考电极插入复眼内。记录电极连接前置放大器(Probe, SYNTECH, Hilversum, 荷兰)，放大器再和数据采集控制器(IDAC-4, SYNTECH, Hilversum, 荷兰)连接, 输出信号输入计算机，由软件Autospike3.9.1(SYNTECH, Hilversum, 荷兰)显示和储存数据。使用另一台微动操作仪移动玻璃刀切断感器尖端，微移记录电极使其稳固套住切断的感器尖端进行单感器记录，同时神经元示踪也已经开始(图1)。

切割感器前，打开气流控制器，使湿润的气流吹向触角，给触角提供高湿的小环境以防止被切割的感器尖端干燥。感器端部贴近记录电极的下缘内表面，记录电极走向L1与感器尖端走向L2大约处于平行状态，玻璃刀端部斜面走向L4与记录电极走向L1大约处于垂直状态(图2)。在玻璃刀端部贴近感器时，轻轻地调节微动操作仪切断感器尖端，随后快速地移走玻璃刀，同时调节微操纵仪使记录电极沿L2向感器微移，进而稳定套住感器尖端。记录电极端部需要切割成约45°的斜面(α≈45°)，直径约3 μm。玻璃刀端部需要切割成约30°的斜面(β≈30°)，直径约1.5 μm。玻璃刀由实心的细玻璃棒拉制后，进行切割而成，而不宜用玻璃管制成，因为后者制作的玻璃刀在切割感器时接触到记录电极尖端的染液后会因毛细现象而吸走记录电极尖端的染液。

图1 单感器记录示意图Fig. 1 Schematic illustration of single sensillum recordingA: 运算放大器Amplifier; C: 玻璃刀Glass cutter; R: 参考电极Reference electrode; Re: 记录电极Recording electrode; S: 感器Sensillum.

图2 感器末端切割示意图Fig. 2 Diagram for cutting sensillum tipL1-5: 直线1-5 Line 1-5; S: 感器Sensillum; Tu: 钨丝Tungsten filament; Re: 记录电极Recording pipette; C: 玻璃刀Glass cutter; α: 记录电极端部斜面角Bevel angle of recording pipette tip; β: 玻璃刀端部斜面角Bevel angle of glass cutter tip.

将棉铃虫性信息素及其类似物化合物气味化合物配制成浓度为1 μg/mL的正己烷溶液。取10 μL气味化合物溶液加在5 mm×30 mm的滤纸条上，待正己烷挥发完毕将滤纸条放入玻璃巴斯德管内作为气味源装置。设置气味刺激控制器(CS-55, SYNTECH, Hilversum, 荷兰)的持续气流(continuous flow)为1.2 L/min，脉冲气流(pulse flow)为0.2 L/min，脉冲时间设置为0.3 s，气流管端口内直径为8 mm，距离端口12 cm处有一个直径2 mm的洞用来插入巴斯德管，端口距离触角约2 cm。

由于电极口部水分的挥发常造成示踪剂浓缩或变干，进而会导致染液无法进一步灌注入神经元，所以在记录完感器功能后需要调节微动操作仪使记录电极进一步套住感器以保持感器切口一直处于液体示踪剂内。保持2 h后，将虫体取下，把感器末端涂抹上凡士林防止感器干燥，放置在4℃、高湿、黑暗条件下2 d。然后，解剖脑组织并放入新鲜磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)(含137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10.1 mmol/L Na2HPO4, 1.8 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)配制的4%多聚甲醛固定液中，室温条件下固定2 h或4℃条件下过夜(约8 h)。固定完毕的脑用0.1 mol/L PBS洗涤4次，每次15 min，之后依次用30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 99%和100%梯度酒精脱水2次，每次10 min，经水杨酸甲酯透明后将样品放入滴加了中性树胶的金属载样片(厚度1 mm)的小孔(直径5 mm)内，盖玻片封闭，写上标签，用激光扫描共聚焦显微镜(LSM 780, ZEISS, Jena, 德国)扫描镜检(Zhao and Berg, 2010)。

1.4 免疫组织化学染色

为了观察嗅觉受体神经元在脑内的区域，将成功标记神经元的脑进行免疫组织化学处理(Zhao and Berg, 2010)。即从载样片内把脑转移至二甲苯[二甲苯∶无水乙醇=1∶1(v/v)的混合液]中浸泡10 min，之后依次用100%, 99%, 95%, 90%, 70%, 50%和30%酒精冲洗2次，每次10 min，紧接着，再用0.1 mol/L PBS洗涤1次，然后将脑放入5%羊血清预孵液(Normal Goat Serum, 16210064, Thermo Fisher Scientific, MA, 美国)内，室温条件下孵育3 h或4℃条件下孵育过夜(约8 h)。随后，将预孵液换为含有突触蛋白抗体的孵育液(Anti SYNORF1, 3C11, Developmental Studies Hybridoma Bank, IA, 美国)中4℃孵育5 d。然后用0.1 mol/L PBS洗涤6次，每次20 min，之后，加入含有Cy2偶联的抗鼠二抗孵育液(Cy2-conjugated anti-mouse, Thermo Fisher Scientific, MA, 美国)中4℃孵育3 d。

若被孵育样品的神经元染色比较淡，需要对样品进行增色处理，即在二抗孵育液进行到第3天时，可将孵育液吸出换为含有0.5% Cy3偶联链霉抗生物素蛋白(016-160-0, Jackson Immunosearch, PA, 美国)的0.1 mol/L PBS室温孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS洗涤6次，每次20 min，依次经30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 99%和100%酒精脱水2次，每次10 min，水杨酸甲酯透明后将样品放入滴加了中性树胶的金属载样片的小孔内，盖玻片封闭，用激光扫描共聚焦显微镜扫描。在该试验过程中，样品全程避光。

1.5 激光扫描共聚焦显微镜扫描数据

使用激光扫描共聚焦显微镜扫描染色标记的嗅觉受体神经元和触角叶，选取488 nm激发光激发Cy2, 543 nm激发光激发Micro-ruby或Cy3。扫描物镜20×物镜，扫描图层间隔为2 μm，分辨率为1 024×1 024，扫描图层总数约为90层。

1.6 数据分析

电生理信号用AutoSpike3.9.1软件进行分析，采用刺激起始1 s后的spike数量减去刺激起始前1 s的数量进行统计。扫描数据用ZEN(ZEISS, Jena, 德国)软件中的Subset和3D功能进行截图处理，用Amira 4.1.1(Visage Imaging, Fürth, 德国)软件中的LabelField功能进行触角叶和神经纤维球的三维结构分析，用SkeletonTree功能进行神经元形态的三维结构分析(陈秋燕等, 2016)。

2 结果

在本研究中，我们仅记录了雄性棉铃虫成虫长毛形感器。我们共测试了12头试虫，其中成功获得电生理记录有5个，成功染色标记的有3个。结果显示所记录的长毛形感器对棉铃虫主要性信息素成分Z11-16∶Ald具有显著的电生理反应，而对正己烷对照和其他类似物没有反应(图3)。染色标记显示对Z11-16∶Ald反应的毛形感器内具有2个受体神经元，其轴突通过触角神经投射到触角叶内纤维球，分别为扩大型神经纤维球复合体的云状体(cumulus, Cu)和普通神经纤维球的G49(图4)。其中投射到云状体的受体神经元轴突末端分支较多，而投射到G49的受体神经元轴突末端分支较少。

3 讨论

单感器记录与受体神经元示踪联用成功记录到雄性棉铃虫长毛形感器对性信息素的反应，并染色标记了其内嗅觉受体神经元。研究结果表明嗅觉受体神经元轴突通过触角神经投射到触角叶神经纤维球，与已报道的黄地老虎(Hanssonetal., 1992)、海灰翅夜蛾(Ochiengetal., 1995)、粉纹夜蛾(Toddetal., 1995)、 烟芽夜蛾(Hanssonetal., 1995; Bergetal., 1998)、烟青虫(Bergetal., 2005)，美洲棉铃虫(Leeetal., 2006a)和Heliothissubflexa(Leeetal., 2006b)等研究结果相似。与前人使用赖氨酸钴作为神经元示踪剂的研究相比，我们使用荧光染料Micro-ruby标记的神经元，便于利用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取整脑和神经元，可获得多层连续图像，适合三维重建分析，可以从不同角度展示神经元在神经纤维球内的投射模式(图4)。

图3 单感器记录棉铃虫雄成虫嗅觉受体神经元对性信息素的反应信号图Fig. 3 Signals of response of odorant receptor neurons on male adults of Helicoverpa armigera tosex pheromones by single sensillum recording (SSR)

图4 棉铃虫雄成虫触角叶扫描图与三维重建图Fig. 4 Scanning and 3D reconstruction results of antennal lobe of male adults of Helicoverpa armigeraA-C: 触角叶和嗅觉受体神经元不同深度(B位于A之后18 μm, C位于B之后18 μm)的激光扫描共聚焦显微图像Laser scanning confocal microscopical image of antennal lobe and olfactory receptor neuron at different depths (B at 18 μm posterior to A, and C at 18 μm posterior to B)； D: 触角叶和嗅觉受体神经元三维重建前面观 Reconstruction of the antennal lobe and olfactory receptor neuron in anterior view; E: 触角叶和嗅觉受体神经元三维重建背面观 Reconstruction of the antennal lobe and olfactory receptor neuron in dorsal view. Cu: 云状体 Cumulus; DMA: 背侧前神经纤维球 Anterior dorsomedial glomerulus; DMP: 背侧后神经纤维球Posterior dorsomedial glomerulus; G49: 神经纤维球49 Glomerulus 49. 方位Directions: a: 前向Anterior; d: 背向Dorsal; m: 内侧Medial; l: 侧面Lateral; p: 后向Posterior; v: 腹面Ventral.

雄性棉铃虫对主要性信息组分Z11-16∶Ald反应的长毛形感器为A型感器(Changetal., 2016; Xuetal., 2016)。染色标记显示该类感器内具有2个嗅觉神经元，与烟芽夜蛾、烟青虫、美洲棉铃虫和H.subflexa的A型感器类似。A型感器具有2个嗅觉受体神经元，但电生理记录仅记录到其中1个神经元的电信号。A型感器的一个神经元表达受体为Or13，配体为Z11-16∶Ald；另一个神经元表达受体为Or11，其调谐配体尚未发现，可能是活性沉默的神经元，所以单感器记录仅记录到对Z11-16∶Ald反应的神经元电信号(Baker, 2009; Changetal., 2016)。染色标记结果表明雄性棉铃虫对Z11-16∶Ald反应的A型感器内两个受体神经元的轴突分别投射到触角叶MGC的云状体神经纤维球和G49普通纤维球，其投射模式与烟芽夜蛾、美洲棉铃虫和H.subflexa的A型感器嗅觉受体神经元投射模式相似，即感器内具有两个受体神经元，一个投射到MGC内的神经纤维球，一个投射到普通神经纤维球(Hanssonetal., 1995; Bergetal., 1998; Leeetal., 2006a, 2006b)。烟青虫对Z11-16∶Ald反应的A型感器内两个嗅觉受体神经元轴突也是分别投射到两个不同的神经纤维球，MGC内体积较小的腹侧神经纤维球和普通神经纤维球，而没有投射到云状体神经纤维球(Bergetal., 2005)，这与Z11-16∶Ald为烟青虫次要性信息素组分而非主要性信息素组分相对应。

本研究结果表明，使用荧光染料Micro-ruby为神经元示踪剂与使用赖氨酸钴作的研究结果一致，但是荧光染色标记的操作和成像方法更简便、易行，所获得多层图像数据有利于进行神经元的三维空间分析。该方法的建立为进一步研究棉铃虫其他气味受体神经元投射路径，明确外周气味受体感受与中枢系统的联系提供了有力技术支持。当然，为了明确单个嗅觉受体神经元在脑内的投射区域，还需要配合使用细胞内记录和染色标记技术或钙离子成像技术(Zhao and Berg, 2010; Wuetal., 2013)。胞内记录和染色技术可以获取单个神经元的形态和功能，而钙离子成像技术接收气味信息的神经髓区域(Zhao and Berg, 2010; Wuetal., 2013)。

致谢河南农业大学屈小娟女士为饲养试虫、杨孟莉博士为使用激光扫描共聚焦显微镜以及挪威科技大学(Norwegian University of Science and Technology)的Bente G. Berg教授为使用Amira软件提供了帮助，在此一并致谢。