一种模块化三维灌注培养系统的研制

刘 鹏，向俊西，杨丽斐，史爱华，刘 爽，吕 毅*

（1.西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安710061；2.精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心，西安710061）

0 引言

目前的生物基础理论大多通过基于培养瓶或培养板的二维静态培养细胞试验得到。典型的二维静态培养将来源人体或动物组织的单一或混合细胞种在塑料或者玻璃平板上，浸泡在营养丰富的培养基中，通过定期更换培养基移除细胞代谢产物、提供新的营养成分。二维静态细胞培养技术经过多年的发展已经十分成熟，是生物学最重要的实验方法之一。但是组织器官中的细胞是三维结构的，而且由血液循环系统不断灌注。而在平板培养中，组织的立体结构、细胞与细胞之间的连接以及细胞与细胞外基质的连接彻底失去[1]，许多细胞实验结果很难在动物体内重现，而即使费时费力在动物体内证实，由于种属差异，相关结果在人体内也时常出现偏差[2-3]。

三维灌注培养在三维静态培养的基础上引入灌注携氧培养基的方法模拟血液循环系统，能够及时移除代谢产物、提供新鲜营养物质，维持培养体系（例如pH、氧气、葡萄糖以及生长因子）的稳态[4-5]。三维灌注培养保留了与体内类似的细胞与细胞及细胞与细胞外基质的相互连接，更能反映体内的生理状态，相关实验结果能够与体内实验结果一致，同时又能体现细胞培养的直观性及条件可控性。将传统二维细胞培养与动物实验模型相结合，为进一步研究体内细胞的正常特征提供了良好的实验平台，可以用于研究组织的病理和生理过程，测试药物毒性和有效性、评估生物材料安全性等[6-7]。灌注培养还能够提供可控的支架强度、机械性能、剪切力、模拟流体动力学效应，增强细胞功能，有效增加组织扩散能力[5，8-10]。此外，携氧培养基能够消除培养组织的大小限制，扩大细胞培养规模，不仅能够为再生医学的临床应用提供大量的种子细胞，还减少了人力、物力和试剂的消耗[2，11]。

目前，三维灌注培养系统无成熟商品，多由实验室自行设计，未进行系统整合。大多将蠕动泵、氧合器、培养瓶、输送管道简单组装而成[12-14]。许多研究则根据实验需求对生物反应器进行了设计以适用于不同组织工程支架，如水凝胶[15]、微流体[16-17]、骨支架[18]、聚合物支架[19-21]的培养，或者设计一些可以提供生物力学信息的生物反应器[22]，少部分研究对培养系统的氧合部分进行了设计[23]。但这些三维灌注培养系统结构复杂、影响因素多、难消毒、易污染，且制作工艺烦琐、难以推广，大大地限制了三维灌注培养的应用[24-25]。因此，本研究设计了一种基于3D 打印技术的模块化三维灌注培养系统，具有结构合理、易消毒、污染少、制作成本低、稳定性高、易于扩展且操作简单的优点，可以很方便地进行基于脱细胞支架的三维灌注培养。

1 设计

针对目前的三维灌注培养系统的缺点，本系统采用集成化、模块化设计，将系统分为生物反应器模块、氧合模块、动力模块和换液模块，如图1、2 所示。各模块可以独立包装，并使用环氧乙烷灭菌，进行细胞培养时将各模块简单连接即可，减少了操作步骤及可能的污染环节。各模块的壳体均通过3D 打印制作而成，易于制作，方便推广。其中生物反应器模块作为细胞培养的容器，装载培养基及细胞支架复合物。氧合模块装载膜肺、空气过滤器、气泡过滤器等，为该培养系统的核心组件。动力模块为整个系统的培养基及气体提供动力。换液模块用来更换培养基，可以对换液接口进行消毒，避免换液过程引起污染。

1.1 生物反应器模块设计

图1 模块化三维灌注培养系统结构示意图

图2 模块化三维灌注培养系统实物图

生物反应器模块主体为80 ml 蓝口瓶，瓶体作为细胞培养容器，瓶盖通过穿板鲁尔接头（桑连电子材料，SL5/32-4.0 mm）连接灌注管路，其中接口1 连接细胞支架复合物，接口2 连接换液模块，且通过此口移除旧培养基及加入新培养基。

1.2 氧合模块设计

氧合模块壳体通过3D 打印制作而成，内部安装有小动物膜肺（西安西京医疗用品有限公司，大鼠型膜肺）、空气过滤器（广州桑连电子材料有限公司，8 mm 过滤器）以及气泡过滤器（湖南省绿洲惠康发展有限公司，IS-GA3），各组件之间通过硅胶软管连接。氧合模块留有空气过滤器观察窗，可监测氧合模块液位变化，预防气泡进入培养系统。

1.3 动力模块设计

动力模块由蠕动泵（兰格恒流泵有限公司，BQ50-1J-A）和空气泵（桑连电子材料，SL-300）组成，放置在培养箱旁，安装在30 cm 高铁架台上，通过12 V直流电源供电。蠕动泵灌注速度调节范围为0～20 ml/min，空气泵流量调节范围为0～300 ml/min。该模块为培养基及氧气提供循环动力。

1.4 换液模块设计

换液模块由10 cm 长硅胶管及3D 打印长方体构成，长方体内部呈倒锥形，底部正中装有深紫外LED 灯[深圳市永霖科技有限公司，TO39，波长（260±5）nm]，可将硅胶软管接头插入换液模块中进行紫外线照射灭菌。

2 使用方法

使用之前对生物反应器模块、氧合模块及换液模块使用环氧乙烷灭菌。在生物反应器中加入50～60 ml 普通或含有携氧成分（如氟碳化合物）的培养基，将该系统按照图1 所示连接。打开蠕动泵及空气泵电源，通过调整氧合模块的倾斜角度来调整气泡过滤器液平高度，将液平高度控制在液壶的2/3 位置。在接口1 处连接待培养的细胞支架复合物。将生物反应器及氧合模块放入培养箱中，将动力模块置于培养箱旁，调整蠕动泵及空气泵至适合速度，对细胞支架复合物进行灌注培养。每日观察培养系统运行状况，并定期更换培养基。更换培养基前打开换液模块的深紫外LED 灯开关，对换液接头照射消毒2 h，关闭动力模块电源，随后连接一次性50 ml 无菌注射器，移除培养瓶中的培养基。使用另一只注射器吸取50 ml 新鲜培养基，连接换液接口注入新培养基，完成对该培养系统的换液。之后再次打开动力模块开关继续进行培养。

3 创新点

本文研制的三维灌注培养系统具有以下创新点：（1）采用模块化设计，安装方便快捷，且各模块可进行环氧乙烷灭菌，解决了既往三维灌注培养系统结构复杂、难消毒、易污染的难题。（2）通过动力模块外置解决了动力部分产热过多的难题，降低了对培养箱温度调节系统的要求。（3）采用标准化组件制作而成，制作成本低，方便推广。（4）可通过局部紫外线照射灭菌，减少了更换培养基过程中污染的可能，提高了系统的稳定性。

4 实验

4.1 材料

4.1.1 实验动物

健康3 月龄SD 大鼠，质量250～300 g，由西安交通大学动物实验中心提供。饲养温度保持在18～25 ℃，标准饲料喂养，实验过程严格遵照国家科学技术部2006 年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

4.1.2 试剂及仪器

试剂为DMEM 培养基、青链霉素（Hyclone）、小牛血清（Gibco）和胰蛋白酶（碧云天）。仪器为本文研制的三维灌注培养系统和CO2恒温培养箱（Thermo Scientific 3110）。

4.2 实验方法

大鼠脾脏脱细胞支架制备方法参照本课题组前期研究[26-28]：经脾动脉插管获取大鼠脾脏，脾脏离体后继续去离子水灌注30 min，随后浸入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中冻存于-80 ℃冰箱备用。反复冻融脾脏2 次后置入烧杯中，连接蠕动泵，设置灌注速度为4 ml/min，先后应用0.2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、PBS 经由脾动脉持续灌注，直至脱去脾脏实质细胞，应用PBS 冲洗后使用0.1%过氧乙酸进行支架消毒，保存在含3%青链霉素的PBS 中。

L02 细胞培养：采用10%小牛血清及1%青链霉素的DMEM 培养基扩增L02 细胞至4×107个，消化离心后使用4 ml 培养基重悬。

采用脾动脉间断注射的方法进行再细胞化脾脏脱细胞支架。将再细胞化脾脏脱细胞支架连接于三维灌注培养系统，整体置于37 ℃的CO2恒温培养箱中。使用10%小牛血清及1%青链霉素的DMEM培养基循环灌注，培养基灌注速度设置为1 ml/min，空气泵速度设置为10 ml/min，间隔3 d 更换培养基。对培养的再细胞化支架进行扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、HE 染色以及Ki67免疫荧光染色观察。

4.3 实验结果

本系统细胞培养实验结果如图3 所示。大体观可见L02 细胞在脾脏脱细胞支架内呈团块状生长，细胞团块体积逐渐增大。培养1 周后的再细胞化脾脏支架SEM 结果显示细胞与支架黏附紧密，细胞在支架内按照脾脏支架内部管腔及血窦结构分布。HE染色结果可见L02 细胞呈现典型的肝细胞形态：细胞核蓝紫色、圆形或椭圆形、大而明显，细胞质丰富，提示细胞活性良好。免疫荧光染色可见Ki67 阳性率为（38±7）%，提示支架中细胞增殖活跃。且利用本系统进行的三维灌注培养均未发生污染。

5 结语

三维灌注培养作为一种能够直接模拟体内真实环境的新技术，是一种理想的细胞培养方式。但是三维灌注培养技术不成熟，既往培养系统结构复杂、易污染，限制了三维灌注培养的发展应用。本研究设计的三维灌注培养系统采用模块化设计，结构合理、易消毒、污染少、制作成本低、稳定性高、易于扩展并且操作简单，值得推广应用。

图3 模块化三维灌注培养系统细胞培养实验结果

但本设计也存在一些不足之处需进行改进：（1）控制及监测模块未集成。可对动力模块的控制系统进行集成及智能化，实现远程控制气体及培养基流量，并能远程监测系统运行状况。（2）缺少储液及废液模块。可增加储液及废液装置，并实现远程控制换液过程，尽可能减少换液环节引入污染的机会。（3）动力模块产热过多。可通过蠕动泵改装水冷装置，增加散热效率，将动力模块置入培养箱中，进一步减少污染的机会。（4）圆形生物反应器模块不利于观察。下一步可改为定制的方形玻璃瓶，以利于观察细胞支架复合物状态。