339株非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定及耐药性分析

秦中华 景晔 杜岩青 宋晓梅 张丽霞

非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌,迄今已发现170多种[1],同时还有新的种别不断被发现。与专性致病菌结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌不同，绝大多数NTM是环境微生物，通常作为机会性病原体，引起局部(皮肤和软组织、淋巴结、骨骼、肺)或播散性感染[2]。从我国结核病流行病学调查资料显示，NTM分离率由1979年的4.3%上升至2000年的11.1%，到2010年的21.0%，反映了我国的NTM病呈明显上升的态势[3]。有研究显示，NTM对常用的治疗药品耐药,导致NTM病的治疗较为困难,且治疗效果不理想[4]。因此，笔者了解天津海河医院NTM病流行状况及耐药性特征，为临床NTM病的诊断和治疗提供参考。

资料和方法

一、 研究对象

天津市海河医院2014年3月至2019年3月应用“DNA微阵列芯片技术”进行菌种鉴定确定的339株NTM。菌株来源于同一患者多次送检样本不重复计算，且选择初次实验室结果纳入统计分析。其中包括痰271份，肺泡灌洗液49份，胸腔积液13份、肺组织穿刺研磨标本6份。

二、实验方法

(一)分枝杆菌培养及初步菌种鉴定

分枝杆菌培养采用BACTEC MGIT 960 系统及配套基础培养基(美国BD公司)，阳性培养物采用对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养基(杭州创新生物技术有限公司)进行初步NTM鉴定。初步鉴定为NTM的菌株进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及分枝杆菌菌种鉴定试验。

(二)药敏试验

药敏试验采用比例法，药品种类和浓度分别是异烟肼(0.2 μg/ml)、利福平(40 μg/ml)、链霉素(4 μg/ml)、乙胺丁醇(2 μg/ml)、对氨基水杨酸(1 μg/ml)、卡那霉素(30 μg/ml)、卷曲霉素(40 μg/ml)、氧氟沙星(3 μg/ml)。

(三)分枝杆菌菌种鉴定

1.方法：DNA微阵列芯片法。

2.仪器：PCR扩增仪、芯片杂交仪、芯片洗干仪(北京博奥生物有限公司)；微型高速离心机(Eppendorf, 5424)。

3.试剂：分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(北京博奥生物有限公司)。

4.操作步骤：参照说明书进行。

结 果

一、 NTM菌种的分布情况

临床分离的339株NTM菌株经菌种鉴定，排在前3位者分别为：胞内分枝杆菌131株，占38.6%；龟-脓肿分枝杆菌72株，占21.2%；堪萨斯分枝杆菌62株，占18.3%(表1)。

表1 339株NTM 菌种鉴定结果

二、不同NTM菌种的药敏试验结果

对罗氏培养出的菌株经“DNA微阵列芯片技术”进行菌种鉴定，并对鉴定出的NTM菌株用比例法对8种抗结核药品(异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星)进行药敏试验，结果：胞内分枝杆菌对上述药品的耐药率分别为95.6%、82.3%、94.7%、54.0%、92.0%、81.3%、85.3%、87.5%；堪萨斯分枝杆菌对上述药品的耐药率分别为100.0%、3.7%、98.1%、11.1%、95.0%、90.0%、27.5%、13.8%；龟-脓肿分枝杆菌对上述药品的耐药率分别为96.9%、93.8%、95.3%、92.2%、88.4%、86.0%、88.4%、87.1%(表2)。

讨 论

NTM广泛存在于水、土壤和灰尘等自然环境中，某些NTM(如鸟分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌)对消毒剂及重金属耐受，使其生存于饮水系统中，其大部分为腐物寄生菌。在供热、供水管道中可分离到嗜热的蟾蜍分枝杆菌、耐热分枝杆菌和缓黄分枝杆菌等。NTM病以潮热地带为多见，人和某些动物均可感染。目前尚未发现动物传染人以及人与人之间传播的证据。现在普遍认为，人可从环境中感染NTM而致病，水和土壤是重要的传播途径[12]。迄今已发现170余种 NTM，其中 37 种已见致病报道[5]。随着检测手段的提高NTM的分离率逐年上升[3]，同时NTM病患者在临床症状、影像学表现等方面与肺结核都十分相似，往往导致临床医生错误判断；使得需要很长的治疗时间，但是治疗效果较差。所以，如何快速准确地检测确定是否为NTM感染就显得尤为重要。目前，国内外大多数实验室采对用硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生长实验作为初步鉴别NTM的方法，操作简单，费用低廉[6]，但其报告时间长，且只能初步筛选NTM，无法满足临床的需求。本研究采用DNA微阵列芯片法进行NTM菌种鉴定，可在短时间提供临床菌种信息，从而使经验用药改为目标用药，为临床精准治疗提供依据。

表2 339株NTM临床分离株中不同菌种对常用药品的耐药率

注表中小括号内数值分子为 “耐药菌株数”，分母为“检测菌株数”。菌株数<15株的菌种采用“耐药菌株数/检测菌株数”表示;a：未检测

本研究发现临床分离出的339株NTM主要是胞内分枝杆菌(38.6%)、龟-脓肿分枝杆菌(21.2%)、堪萨斯分枝杆菌(18.3%),与吴海良等[7]统计的山东地区NTM菌种病原谱分布情况一致，与广东地区[8]、上海地区[9]报告的 NTM菌种分布资料不同。这可能是地区性差异或临床分离株数量少[9]、病种分布不同所造成。

多数NTM对抗结核药品耐药，用抗结核药品治疗疗效不佳。而NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁通透屏障是其广谱耐药的生理基础，是有效化疗的障碍。为了克服药品进入细胞的屏障，主张应用破坏细胞壁的药品(如乙胺丁醇)与抑制细菌蛋白质(酶)的合成的药品(如链霉素)、阻碍细菌mRNA合成的药品(如利福平)联用。其原因为链霉素和利福平都是杀菌药，链霉素的主要作用机制是通过阻止氨基酰tRNA与细菌核糖体30S亚单位的结合，从而抑制蛋白质合成时肽链的移位；利福平亲脂性高，很容易通过分枝杆菌的细胞膜，通过与DNA依赖的RNA聚合酶β亚基的rpoB基因结合从而抑制转录。乙胺丁醇是一个抑菌药，对分枝杆菌细胞壁的破壁作用，有效地促进了其他药品进入细菌体内的速度，提升了胞内的药品浓度，与其他的抗结核药品有协同的作用，而且可以延缓其他药品耐药性的产生。大多数 NTM 对常用的抗分枝杆菌药品耐药，因此，NTM病的治疗较为困难，且疗效大多不理想[10]。本研究数据显示，临床分离的NTM菌株对一线、二线抗结核药品总的药耐率在50%以上，这与吴海良等[7]报道的山东地区和张娟等[11]报道的沈阳地区NTM临床耐药情况基本一致。

本研究数据显示，作为主要临床NTM分离株的堪萨斯分枝杆菌对乙胺丁醇、利福平、卷曲霉素、氧氟沙星具有很好的敏感性，这与中华医学会结核病学分会《非结核分枝杆菌病诊断和治疗》[12]专家共识推荐，对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌病患者，仅需进行利福平药敏试验的指导意见一致；但胞内分枝杆菌和龟-脓肿分枝杆菌对上述药品均具有较高的耐药性，提示临床进行经验治疗过程中应该注意药品的选择和菌种的鉴定。

综上所述，随着临床重视度及实验室诊断技术的不断提高，NTM临床分离率呈现逐年增高趋势，同时感染后临床表现与结核分枝杆菌临床表现极为相似，但对常用抗结核药品又大部分具有耐药性，因此对NTM进行快速准确的鉴定和药敏试验有助于精准地对NTM病实施临床治疗。