玉米干种子DNA快速提取技术研究

王宇龙 尚千铅 张帆 杨海燕 楚海娇

摘 要：以玉米干种子为提取材料，采用磁性纳米微球作为吸附介质进行基因组DNA的提取，分别探讨不同裂解液、裂解温度、时间和磁珠用量对基因组DNA提取效率的影响。结果表明裂解液2%CTAB、裂解温度65 ℃、裂解时间10 min、磁珠用量15 ?L时基因组DNA提取浓度高、纯度好、适宜后续实验。

关键词：玉米;DNA;提取

Abstract：Using maize seeds as materials， extracted the genomic DNA by magnetic nanospheres.The results showed that when the lysate was 2%CTAB， the pyrolysis temperature was 65 ℃， the time was 10 min and the dosage of magnetic beads was 15 ?L， the genomic DNA extraction concentration was high， the purity was good， and it was suitable for subsequent experiments.

Key words：Maize; DNA; Extraction

玉米转基因成分的检测主要是基于基因水平的检测，PCR技术是常用的检测手段，而高质量的DNA是后续PCR检测成功与否的前提条件[1]。针对玉米的DNA提取最常用的方法是CTAB法，而传统的提取方法存在操作过程繁琐、耗时耗力、使用有毒溶剂及不能自动化提取等缺点[2]。为克服以上缺点，本试验采用近年来在核酸分离纯化领域备受瞩目的磁珠分离技术，以玉米干种子为提取材料进行DNA提取，同时对提取条件进行优化，建立了一种玉米干种子DNA提取的磁性分离方法，旨为玉米转基因快速检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米干种子，由吉林农业科技学院农学院提供;磁珠，由吉林化工学院提供。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

取玉米干种子若干粒，于粉碎机中粉碎成粉末。

1.2.2 提取步骤

①称取0.04 g玉米粉末转移至预先装有400 μL裂解液的无菌离心管中，迅速颠倒混匀。②水浴10 min，每隔5 min颠倒混匀。③12 000 r·min-1离心5 min后将上清液移至新的1.5 mL无菌离心管中。④加入与上清液等体积的异丙醇及一定体积的磁珠工作液，振荡混匀。⑤用磁分离架分离磁珠并弃上清。⑥加入900 μL漂洗液洗涤3次，分离磁珠弃上清，吹干磁珠后加入100 μL洗脱液，充分混匀，65 ℃水浴10 min。⑦转移至磁力架上吸附2 min，待磁珠完全吸附后，将溶液转移至新的离心管中，置于-20 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 裂解液对DNA提取效果的影响

细胞的充分裂解是获得高质量DNA的前提。本试验配制7种提取裂解液对玉米干种子进行DNA提取，经超微量紫外分光光度计测量浓度和纯度，结果见表1。裂解液Ⅰ的浓度最低，裂解液Ⅱ次之;以CTAB作为裂解液时DNA浓度均较高，而单独使用2%CTAB提取时浓度最高;加入不同摩尔浓度的盐酸胍后DNA浓度没有提高。采用7种裂解液提取的DNA纯度均较好，除使用SDS裂解液的OD260/OD280为2.08，存在少量RNA污染外，其他比值均在1.8～2.0。纯净DNA样本的OD260/OD230应该大于2，采用盐酸胍和异硫氰酸胍作为裂解液的比值分别为1.62和0.22，可能存在盐离子或胍盐残留。结合电泳图1可见3～6号泳道DNA条带明亮清晰，无拖尾弥散现象，完整性好。因此，认为2%CTAB为最佳裂解液。

2.2 裂解温度对DNA提取效果的影响

为获得最佳裂解温度，分别采用55、65、70 ℃和75 ℃對玉米干种子进行DNA提取比较，结果见表2。裂解温度为70 ℃时，DNA样本浓度最高;65℃时最低;4种裂解温度下DNA样品均无蛋白质和RNA污染，但OD260/OD230存在差异，只有在65 ℃时，比值大于2.0，这可能与其浓度相对较低，携带杂质较少有关。由图2可见，4条电泳条带均清晰整齐，虽然2号泳道的条带偏暗，浓度略低，但其纯度最好，且其提取浓度足以满足后续实验要求。因此选择65 ℃作为最佳裂解温度。

2.3 裂解时间对DNA提取效果的影响

裂解时间影响DNA的提取质量，分别选择5、10、20 min和30 min进行DNA提取，结果见表3。裂解时间为10 min时，浓度最高;随裂解时间增长，浓度降低。OD260 nm/OD280 nm均在1.9～2.0，符合浓度要求。而OD260 nm/OD230 nm存在差异，只有裂解时间为10 min时，比值大于2，说明纯度较好;裂解5 min时，OD260 nm/OD230 nm为11.90，可能存在其他成分干扰或者洗涤后残余乙醇所致。结合电泳图3发现，4条电泳条带均整齐清晰，完整性好。综合认为，裂解时间为10 min较合适。

2.4 磁珠体积对DNA提取效果的影响

在其他提取条件相同的情况下，分别加入10、15、20 μL和25 μL的磁珠进行DNA提取，结果见表4。加入15 μL磁珠时，DNA含量最高;随体积增加，DNA含量下降。磁珠体积为15 μL时，DNA较纯净，而其他3组DNA存在不同程度的污染。结合图4认为，对于本实验使用的磁珠类型，选择15 μL的磁珠体积较合适。

3 结论

试验选取玉米干种子作为提取材料避免了种子萌发周期较长的问题，取材更加方便[3]。对裂解液进行优化，发现采用2%CTAB进行提取时DNA质量最好，这也是传统玉米DNA提取方法中使用最广泛的细胞裂解液;采用CTAB和盐酸胍组合裂解时发现加入盐酸胍后DNA质量没有提高，因此为节约成本，确定2%CTAB为最佳细胞裂解液;试验确定65 ℃为最佳裂解温度，与大多数文献报道相吻合;裂解时间为10 min时，DNA质量最好，随着裂解时间延长，DNA含量和纯度逐渐下降，说明裂解时间过长，可能造成DNA降解;而裂解时间过短，DNA不能充分释放出来[4];最佳磁珠体积为15 ?L。

参考文献：

[1]陈笑芸，汪小福，周育等.转基因大豆深加工食品DNA鉴定技术研究[J].中国食品学报，2013，13（4）：156-162.

[2]赵卫东，郑文杰，王爱迪等.磁性微球在植物源性转基因食品检测中的应用[J].食品研究与开发，2012，33（6）：128-130.

[3]魏琦超，畅丽萍，周岩等.利用改良CTAB法提取小麦干种子总DNA[J].山西农业科学，2009，37（6）：30-32.

[4]刘 捷.植物基因组DNA提取试剂盒提取玉米基因组DNA的条件优化[J].种子世界，2017（11）：22-23.