两种水稻蛀茎害虫精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

鲁艳辉 郑许松 田俊策 白琪 吕仲贤

摘要 精氨酸激酶（AK， EC 2.7.3.3）是昆蟲体内唯一的磷酸原激酶，参与能量代谢。为探究AK基因的作用，本文利用本实验室建立的cDNA文库及RACE技术，分别从两种重要的水稻蛀茎害虫稻蛀茎夜蛾Sesamia inferens和二化螟Chilo suppressalis中克隆获得了AK基因的cDNA全长序列，并对其序列特征进行分析。AK基因分别命名为SinAK（稻蛀茎夜蛾，GenBank登录号：MK559476）和CsuAK（二化螟，MK559475），开放阅读框（ORF）长为1 065 bp，编码355个氨基酸，预测蛋白质分子量为40.0 kDa，等电点为5.88。氨基酸序列分析结果显示SinAK、CsuAK基因编码的氨基酸序列具有AK典型的功能位点保守序列：底物识别域S62G63V64-Y67和酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT。氨基酸序列比对及系统进化关系分析表明，SinAK与甜菜夜蛾、草地贪夜蛾和斜纹夜蛾的同源性最高，达95%以上，而CsuAK与印度谷螟、亚洲玉米螟的进化关系较近，同源性在95%左右。SinAK、CsuAK与其他昆虫AK的氨基酸序列同源性也高于80%，而与部分脊椎动物起同样作用的肌酸激酶（CK）的同源性低于40%，说明AK基因的功能是高度保守的，且与脊椎动物CK同源性很低。本研究结果为进一步研究SinAK和CsuAK的功能以及开发以AK基因为靶标的、对高等动物安全的害虫防治新技术奠定基础。

关键词 水稻蛀茎害虫; 稻蛀茎夜蛾; 二化螟; AK基因; 克隆; 序列

中图分类号： S 435.112.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019083

Cloning and sequence analysis of arginine kinase genes from two rice stem borer species

LU Yanhui， ZHENG Xusong， TIAN Junce， BAI Qi， L Zhongxian

（State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control， Institute of Plant Protection

and Microbiology of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China）

Abstract

Arginine kinase （AK， EC 2.7.3.3） is an important regulation factor of energy metabolism in insect species. Aimed to explore the role of AK genes， in this study， two AK genes， named SinAK （GenBank accession number： MK559476）， CsuAK （MK559475） were isolated from Sesamia inferens and Chilo suppressalis larvae， respectively， using cDNA library and RACE methods. Either cDNA sequence contained a 1 065 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 355 amino acids with the predicted molecular weight and isoelectric point of 40.0 kD and 5.88， respectively. Amino acid sequence analysis showed that the SinAK and CsuAK sequences had the typical characteristics of arginine kinase， which contained the substrate recognition region S62G63V64-Y67 and the active site CP（S/T）N（I/L）GT. The results of sequence comparison and phylogenetic analysis showed that SinAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Spodoptera exigua， Spodoptera frugiperda and Spodoptera litura， while CsuAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Plodia interpunctella and Ostrinia furnacalis. The amino acid sequence identities of SinAK and CsuAK with other insect AKs were also higher than 80%， while those with creatine kinases （CK） which play the same role in some vertebrates were lower than 40%. These results indicated that the function of AKs gene is highly conserved but they shared very low homology with vertebrate CK. Our results lay a foundation for further study of the functions of SinAK and CsuAK， and for the development of new pest control technologies targeting AK genes， which is safe for higher animal.

Key words

rice stem borer; Sesamia inferens; Chilo suppressalis; AK gene; clone; sequence

磷酸原激酶是一大类酶的总称，多位于动物体内能量消耗较大的组织，对动物体内能量的储存、代谢和利用具有至关重要的作用[12]。精氨酸激酶（arginine kinase， AK， EC 2.7.3.3）是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶[3]，起着类似于脊椎动物肌酸激酶（creatine kinase， CK）的作用，它通过催化精氨酸和ATP之间的可逆性反应，将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中，或将磷酸精氨酸分解产生ATP[4]。近年来，关于AK的研究主要集中在基因序列。基因编码氨基酸，氨基酸序列決定着蛋白的空间构型，因此，分析AK基因编码的氨基酸序列及其特征，能够明确酶的活性中心，为后续的AK功能研究奠定基础[5]。迄今为止，人们已在鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目和蜚蠊目等昆虫中发现AK[59]，并克隆分析了AK基因及其序列特征。主要包括南美沙漠蝗Schistocerca americana[10]、西方蜜蜂Apis mellifera[11]、印度谷螟Plodia interpunctella[12]、家蚕Bombyx mori[4， 13]、东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis[1415]、大红芫菁Cissites cephalotes[16]、美洲大蠊Periplaneta americana[1718]、棉铃虫Helicoverpa armigera[19]、红火蚁Solenopsis invicta[20]、意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica[21]、烟青虫Helicoverpa assulta[22]、家蝇Musca domestica[23]等多种昆虫，推动了昆虫AK相关研究工作的开展。

稻蛀茎夜蛾（原称大螟）Sesamia inferens（Walker）和二化螟Chilo suppressalis（Walker）是水稻的主要钻蛀性害虫，是大部分水稻产区的蛀茎害虫优势种，分别属于鳞翅目夜蛾科Noctuidae和螟蛾科Pyralidae，东亚地区主要发生分布在中国、韩国、日本水稻产区，直接威胁农业生产[24]。目前，对于水稻蛀茎害虫的防治，我国多施用化学药剂。但由于化学药剂的长期、大量、不合理使用等原因，导致害虫抗药性水平不断提高，田间防效下降，从而加剧了蛀茎害虫危害，而且对环境生态安全和食品安全造成严重的影响。因此，在控制害虫抗药性的策略上，筛选新的杀虫剂作用靶标已成为农药创新领域的重要方向。

已有研究表明，AK是昆虫肌肉中唯一有效形成ATP 的磷酰基供体，这就意味着昆虫具有与脊椎动物完全不同的能量代谢途径[5， 1617， 22， 2526]，若将AK作为靶标，开发害虫防治新技术，不仅可以开辟害虫分子调控的新领域，而且对高等动物也比较安全[22， 27]。本文以两种重要的水稻害虫为研究对象，利用本实验室建立的cDNA文库和RACE技术，克隆其AK基因并分析该基因的序列特征，旨在为深入研究AK的表达、调控、功能以及探求水稻蛀茎害虫绿色防控的分子靶标提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

稻蛀茎夜蛾和二化螟室内种群采自浙江省杭州市萧山区义桥镇（30°07′ N， 120°21′ E）水稻田，采用人工饲料在人工气候室饲养，饲料配方及饲养方法参考中国水稻研究所的方法（稻蛀茎夜蛾[28]，二化螟[29]）。饲养条件：温度 27℃±1℃，相对湿度（70±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h。成虫利用10%的蜂蜜水饲养。

1.2 总RNA提取

两种蛀茎害虫总RNA的提取采用TRIzol试剂，具体步骤参照TRIzol试剂说明书（Invitrogen）。取1 μL RNA样品测定OD260/280（Nanodrop 2000），比值在1.8～2.2之间的样品用于cDNA合成。

1.3 AK基因全长序列的获得

通过对本实验室建立的稻蛀茎夜蛾和二化螟cDNA文库测序，分别获得了这两种水稻害虫AK基因的cDNA序列，利用Primer 3.0软件设计RACE引物（表1）。取这两种害虫的3龄幼虫，按照上述操作步骤提取总RNA，取1.0 μg RNA，按照RACE试剂盒（TaKaRa-Clontech）的操作说明合成5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA。用RACE引物F1和R1分别与试剂盒提供的UPM引物进行第一轮PCR扩增，以RACE引物F2和R2分别与试剂盒提供的NUP引物进行第二轮扩增。两轮PCR扩增程序同为：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸5 min。扩增片段与pMD-18T载体（TaKaRa）连接，转化，菌落PCR鉴定正确后进行测序（南京擎科生物科技有限公司）。

1.4 序列分析

测序结果采用DNAMAN软件进行拼接，获得两种水稻害虫AK基因的全长cDNA序列。序列同源性比对采用ClustalW软件（http：∥www.genome.jp/tools/clustalw/）。利用MEGA 5.1软件建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 两种水稻害虫AK基因全长cDNA序列的克隆与特征分析

克隆获得两种水稻害虫AK基因的全长cDNA序列，分别命名为SinAK（稻蛀茎夜蛾）和CsuAK（二化螟）。SinAK基因cDNA全长为1 422 bp，CsuAK基因cDNA全长为1 597 bp。开放阅读框（ORF）均为1 065 bp，编码355个氨基酸，预测蛋白的分子量为40 kDa，等电点为5.88。GenBank登录号分别为，稻蛀茎夜蛾MK559476、二化螟MK559475（图1～2）。预测到一个底物识别域S62G63V64-Y67;酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，位于氨基酸270-276;一个肌动蛋白结合域ENKTFLVWCNE，位于氨基酸213-223（图1～2）。

2.2 两种水稻害虫与其他动物AK或CK序列的比对

将克隆获得的稻蛀茎夜蛾和二化螟AK基因与NCBI数据库（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中注册的部分昆虫AK和其他物种的CK编码氨基酸序列进行比对，发现其与鳞翅目昆虫的AK基因编码的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;与其他昆虫，例如褐飞虱Nilaparvata lugens（Stl）（半翅目）和黑腹果蝇Drosophila melanogaster（双翅目）的同源性较高，在80%左右;与几种害虫的天敌昆虫如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita、二化螟盘绒茧蜂Cotesia chilonis的同源性也較高，在80%左右;而与人Homo sapiens、电鳐Tetronarce californica、褐家鼠Rattus norvegicus的CK的同源性较低，低于40%（图3，表2）。

2.3 两种水稻害虫与其他动物AK或CK序列的系统进化树分析

采用MEGA 5.1软件对NCBI数据库中注册的部分昆虫的AK和部分脊椎动物的肌酸激酶的氨基酸序列构建了系统进化树，进化树显示两个大的分支，一支为精氨酸激酶类，另一支为肌酸激酶类（图4）。进化树的结果显示：SinAK和CsuAK氨基酸序列归属于AK分支。SinAK与甜菜夜蛾Spodoptera exigua、草地贪夜蛾S.frugiperda和斜纹夜蛾S.litura的同源性最高，达95%左右;CsuAK与印度谷螟Plodia interpunctella、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的进化关系较近，同源性在95%左右;虽然与几种害虫的天敌昆虫如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita也属于同一AK分支，但同源性相对低一些，在80%左右（图4）。

3 讨论

目前，人们在多种昆虫中发现AK，主要集中在鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目、双翅目和蜚蠊目中。许多研究表明，AK是昆虫体内唯一能够形成有效ATP 的磷酰基供体[5]，但关于稻蛀茎夜蛾和二化螟这两种重要水稻害虫AK基因的研究相对较少。本研究利用已建立的cDNA文库和RACE技术，获得稻蛀茎夜蛾和二化螟AK基因cDNA全长序列，分别命名为SinAK（GenBank登录号：MK559476）和CsuAK（GenBank登录号：MK559475）。ORF均为1 065 bp，编码355个氨基酸，预测蛋白的分子量为40 kDa，等电点为5.88。这与NCBI中注册的大部分昆虫AK相似。氨基酸序列中预测到一个底物识别域S62G63V64-Y67，酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，一个肌动蛋白结合域ENKTFLVWCNE，其中酶活性中心序列中含有保守的半胱氨酸C270，这些都是AK基因的功能位点。Gattis等研究表明，酶活性中心序列中的半胱氨酸在精氨酸激酶的催化过程中起关键作用[31]。将克隆获得的SinAK、CsuAK与NCBI数据库中注册的其他昆虫AK基因进行比对分析，发现其与鳞翅目昆虫的AK基因编码的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;与褐飞虱和黑腹果蝇的同源性较高，高于80%，且上述几个功能位点都是高度保守的，说明AK基因的功能是高度保守的[32]。而SinAK、CsuAK与部分脊椎动物，比如人、电鳐、仓鼠的肌酸激酶的同源性低于40%。进化树的结果显示SinAK与甜菜夜蛾、草地贪夜蛾和斜纹夜蛾的同源性最高，达95%左右;CsuAK与印度谷螟、亚洲玉米螟的进化关系较近，同源性在95%左右，这应该与昆虫的分类地位相关，稻蛀茎夜蛾与甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾同属于鳞翅目夜蛾科，而二化螟与印度谷螟和亚洲玉米螟同属于鳞翅目螟蛾科。

精氨酸激酶是昆虫能量代谢途径中的关键酶，且仅存在于无脊椎动物体内，与脊椎动物中起同样作用的肌酸激酶序列同源性较低，可作为害虫防治的一个分子靶标。本文结果为揭示稻蛀茎夜蛾、二化螟AK的基因功能奠定基础，为利用以SinAK、CsuAK基因为靶标的水稻绿色防控技术的研发提供了基础依据。虽然以AK基因为靶标的防控策略可以保证脊椎动物的安全，但天敌昆虫的AK基因序列与害虫较为相似，以AK基因为靶标可能会作用于天敌。幸运的是天敌与害虫的AK基因同源性为80%左右，因此仍有空间寻找对害虫特异性的靶标，导入双链RNA（dsRNA）干扰AK基因的功能，从而导致害虫生长发育受阻，甚至死亡。在后续的工作中我们将侧重于在害虫与天敌AK基因差异较大的序列区域开展潜在的特异性靶标研究。

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（责任编辑：杨明丽）

收稿日期： 20190226   修订日期： 20190627

基金项目：国家自然科学基金（31672050）;浙江省重点研发计划（2018C02032）;浙江省“三农六方”科技协作项目（CTZB-F170623LWZ-SNY1）

致  謝： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。

通信作者 E-mail：luzxmh@163.com

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