功能性磷脂的酶法合成及其生理功能研究进展

肖志刚, 杨国强, 杨 舒, 段玉敏, 张雪萍, 邱天昊

(1. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳大学 生命科学与工程学院, 沈阳 110044)

0 引 言

磷脂(phospholipids)是一种含有磷酸的混合物质,在植物与动物中普遍存在,是构成生物膜的基本组成成分,也是生命基础不可缺少的物质。大量研究表明磷脂具有丰富的营养价值,可以降低胆固醇、加快脂肪代谢速率、预防高血压与心血管等疾病,但是我国对磷脂资源开发与加工程度不太高,生产技术的不成熟使得磷脂的营养与功能价值利用低,造成大量磷脂资源的廉价与浪费[1]。可见,充分利用开发高附加值磷脂的产品尤为重要,已有研究表明以磷脂形式提供的脂肪酸在婴儿大脑中的转化吸收效率是甘油三酯(TAG)的2.1倍,且以磷脂形式提供的脂肪酸在肝、肺、血浆和红细胞中也更易于吸收,也有人证实其在体内的生物利用度高于TAG[2-4]。因此功能性磷脂产品的开发及其生理功能的研究已引起研究人员的高度重视,如Peng等[5]用固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化合成富含功能性磷脂,Marsaoui等[6]用固定化脂肪酶催化合成了富含多不饱和脂肪酸的磷脂。Kim等[7]分别用游离与固定化LecitaseUltra酶催化DHA/EPA 和磷脂酰胆碱制备富含DHA/EPA的磷脂酰胆碱。然而,关于功能性磷脂的合成手段及其结构、组成、生理功能等方面的研究进展鲜有报道。因此,本文对功能性磷脂的合成方法、组成分析方法、生理功能的最新的研究方向做了详细的论述与探讨,期望能够为今后磷脂的研究方向提供一些思路与想法。

1 功能性磷脂的概述与发展

功能性磷脂是利用现代酶技术对磷脂进行结构组成与位置的改性,通过新的分离技术手段将目标产物分离所得到的产品,使其中的脂肪酸组成及其位置分布被具有特殊生理功能的脂肪酸替代,使其具有特殊的生理功能与价值。大量研究表明,功能性磷脂具有促进大脑神经系统发育、提高记忆力、降血脂、降低胆固醇、抗衰老、预防癌症等众多生理功能[8-9]。具有特殊的生理功能的脂肪酸因其在脂肪中的分子形式不同而有差异。以磷脂形式存在的功能性脂肪酸,不仅同时具有磷脂和功能性脂肪酸的生理功能,而且结构更稳定、不易于发生氧化反应,更有利于人体的吸收与利用。在食品、化妆品、医药等多个领域,具有重要的开发应用价值。近年来,随着酶工程技术和脂肪酶技术的发展,以脂肪酶为催化剂通过化学反应获得具有功能型磷脂的产品成为可能。如国外Vikbjerg等[10]以固定化脂肪酶LipozymeTLIM为催化剂,在有机溶剂正己烷体系中催化大豆磷脂与癸酸的酯化反应,生成癸酸型磷脂。Reddy等[11]利用2种固定化脂肪酶LipozymeTLIM和Novozym435催化软脂肪酸、硬脂酸分别与蛋黄卵磷脂及大豆卵磷脂进行酯交换反应,分别生成软脂肪酸磷脂与硬脂肪酸磷脂。Svensson等[12]采用5种脂肪酶为工具酶,以卵磷脂与烯酸为原料进行酸解反应并进行比较,反应合成烯酸磷脂,最大的合成率达到30%。欧美和日本等国家功能性磷脂的生产技术比较成熟与完善,对比我国对功能性磷脂的制备与生产才刚开始发展阶段,许多生产技术还尚在研究阶段。如潘丽等[13]用固定化脂肪酶Novozym435催化在有机溶剂中让大豆卵磷脂与EPA、DHA进行酯化反应生成EPA和DHA型磷脂。张苓花等[14]也利用酶法合成了含EPA和DHA的卵磷脂。目前,我国所得功能性磷脂产品的生产技术还不成熟与完善,功能性磷脂产品的质量与含量都比较低,与市场需求还有差距,今后对功能性磷脂的发展还有比较大的提升空间与力度,在未来还有更多的方向有待开发,也有更广阔的发展前景。

2 功能性磷脂的酶法合成

2.1 底物的选择

功能性磷脂的结构是包含磷酸根的甘油三酯的统称,含有脂肪酸链团的基本甘油结构部分和必需的磷酸基团部分,其分子结构通式与大豆磷脂相近,不同之处在于甘油骨架上脂肪酸组成的不同,功能性磷脂主要指具有特殊生理功能性的脂肪酸,如:CLA、LNA、DHA/EPA、ARA等,合成功能性磷脂底物的选择是非常重要的一个环节。如Ghosh等[15]利用脂肪酶催化豆蔻酸、癸酸、月桂酸、及亚麻酸甲酯与大豆磷脂发生酯化反应,生成不同的功能性磷脂,实验结果说明底物选择的脂肪酸分子量越大,酯交换反应过程与磷脂的结合效果会越好,得到底物选择的脂肪酸影响酯交换反应合成产物的反应速率。杜俊民等[16]以亚麻酸乙酯为酰基供体与磷脂进行酯交换反应,酯交换反应亚麻酸的合成率达到20%,它们选择了底物不同的亚麻酸乙酯和亚麻籽油分别与磷脂发生酯化反应,比较研究发现亚麻酸乙酯与磷脂的合成效率最高。为了高效合成富含特殊生理功能性的脂肪酸,通常选择富含功能性不饱和脂肪酸油与磷脂酰胆碱含量丰富的大豆磷脂与蛋黄卵磷脂等作为反应底物,选择不一样的底物酰基供体与磷脂发生酯化反应,在同一脂肪酶的催化下,合成功能性磷脂的效果会不同,因此,想得到一种有营养价值、生理功效特别高的功能性磷脂,通常选择富含特殊功能性脂肪酸的底物作为酰基供体的来源,但由于功能性脂肪酸的不饱和键比较多在空气中易于氧发生反应变质,所以,选择底物富含多不饱和的油脂直接作为酰基供体与磷脂发生酯交换反应效果会好。

2.2 催化剂的选择

催化剂是指在反应过程中能够使化学反应速率发生改变,但自身只起到催化作用,不发生任何改变的物质。催化剂种类特别多,其中包括催化酯交换反应的脂肪酶。脂肪酶在生物体内中存在,组成以蛋白质为主,结构中以氨基酸构成催化结构体[17]。与物理、化学催化剂相比较,脂肪酶具有反应速率快,专一性强,来源广泛,利于环保等优势。选择合适的脂肪酶催化剂可以促进酯交换反应的速率,将磷脂与酰基供体更好地结合起来。如今,市场上生产与研究应用多的固定化脂肪酶主要有LipozymeRMIM、LipozymeTLIM与Novozyme435,随着生物工程技术的出现,从微生物、植物中能够提取到新的脂肪酶的催化效果非常明显,提取的成本也比较低,有希望能够更好地应用到合成功能性磷脂的制备与研发中。如:孙瑞清等[18]在有机溶剂体系中用LipozymeTLIM脂肪酶为催化剂催化磷脂与癸酸的酯化反应最终得到癸酸的合成率为6.5%。班婷婷等[19]利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM为催化剂,以大豆磷脂与棕榈酸为原料,对反应温度、反应时间、底物摩尔比、磷脂浓度、酶添加量、加水量等条件进行了单因素优化,得到棕榈酸合成率为35%。

在酶法催化合成功能性磷脂中,选择合适的脂肪酶作为催化剂,需要考虑到对脂肪酶的催化效果,影响的因素主要有:反应温度、反应时间、反应环境pH、反应溶剂、含水量。研究发现,多数脂肪酶反应温度最适宜的范围在40-60℃,反应温度的过高与过低都不利于脂肪酶的催化效果。反应时间也是脂肪酶催化效果好坏的重要组成因素之一,大多数脂肪酶的催化时间不低于18h,反应时间的长短能够促进酶的催化效果,对于脂肪酶的反应环境pH值因脂肪酶的种类不同而不同,微生物的脂肪酶一般接近于中性,而在植物与动物中提取的一些脂肪酶偏向于酸性与碱性。在脂肪酶催化速率中反应溶剂的有无与多少,可以直接影响反应得率与速率,一般来说,在有机溶剂中能够加快反应的速率,有机溶剂能够增大酶与底物接触面积,使反应更快地进行。含水量主要指酶自身的水分与加的水量,研究表明,含水量在占酶量的3%～10%范围内,反应速率和产物得率保持在较高的水平。在选择合适的脂肪酶的时候,酶自身的稳定性也是特别重要的一环,需要针对酶的稳定性做出研究与分析,对脂肪酶反应因素的研究旨在为选择合适的脂肪酶做出指导与帮助,以提高脂肪酶催化速率为前提,最终使得酯化反应的得率提高,以期为脂肪酶应用到生产中提供帮助与基础[20-23]。

2.3 酶法合成功能性磷脂的分类

功能性磷脂的合成是指利用脂肪酶为催化剂,在一定反应条件下,以底物磷脂和提供脂肪酸的酰基供体为原料,经过酯化反应后生成不同类型的功能性磷脂。功能性磷脂合成的酯交换反应种类可以分为以下2个方面。

1) 脂肪酶催化磷脂同脂肪酸与脂肪酸酯的酯交换反应

脂肪酸与脂肪酸酯直接作为提供脂肪酸的酰基供体,在酯交换反应中是十分有效和常见的。首先第一种情况是大部分的研究主要在磷脂和脂肪酸的酯化反应上,能够得到组成成分与功能不同的改性磷脂,脂肪酸与磷脂之间的反应也叫磷脂的酸解作用。如今有大量的研究集中在引入多不饱和脂肪酸与磷脂发生的酸解反应。如曾朝喜等[24]研究了以固定化脂肪酶Lipozyme RMIM为工具酶,催化卵磷脂与共轭亚油酸进行酸解反应,最终得到产物共轭亚油酸磷脂中共轭亚油酸的含量达到24%。Mustranta等[25]利用2种新型微生物脂肪酶催化了磷脂酰胆碱和油酸进行酯化反应,比较无溶剂体系与有机溶剂体系下催化效果,得到油酸磷脂的油酸得率达到35%。另一种情况是脂肪酸酯提供酰基供体与磷脂发生酯交换反应,将具有特殊功能的多不饱和脂肪酸结合到磷脂的甘油骨架上,如Park等[26]在有机溶剂下,利用磷脂酶A2为催化剂,催化酰基供体烯酸乙酯与卵磷脂的发生酯交换反应,研究了反应温度、底物摩尔比等反应条件对酯交换反应的影响,反应结束后含EPA磷脂的合成率达到14%。

一般来说,脂肪酶催化磷脂同脂肪酸与脂肪酸酯的酯交换主要以磷脂的甘油三酯骨架与游离不饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸酯为酰基供体作为反应物,在脂肪酶催化下发生了组成成分与结构的变化,最后再考察功能性磷脂的肪酸酸组成及其分布、结构特性以及确定最佳反应条件。

2) 脂肪酶催化磷脂和甘油三酯的酯交换反应

甘油三酯是指由甘油与脂肪酸结合形成的酯类物质,与脂肪酸相比分子量大,在酯交换反应过程中由于分子含量高,产生的空间阻力会比较强,这会对酯交换反应过程造成一定的影响。如今,对于国内外研究甘油三酯与磷脂发生酯交换反应还不够多,且主要研究集中于磷脂和动物鱼油的酯交换反应过程中。如Totani等[27]以沙丁鱼油和磷脂为反应底物,以新型Candidacylindracea脂肪酶为催化剂时,催化它们发生酯交换反应后,得到磷脂的合成率为45%。Wang等[28]利用脂肪酶Rhizomucormiehei催化卵磷脂与鱼油进行酯交换反应,研究了反应温度、酶添加量、底物摩尔比等反应条件对酯交换过程的影响,在优化的最优条件下EPA/DHA磷脂的合成率达16%。

Arboleda等[29]利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化磷脂分别与亚麻籽油和石榴籽油进行酯交换反应,合成富含共轭亚油酸的磷脂,其合成率分别达到5%和11%。

与脂肪酸和脂肪酸酯相比,甘油三酯的来源非常丰富,甘油三酯来源于天然的油,如鱼油、亚麻籽油等油料,甘油三酯与磷脂直接进行酯交换反应过程,可以缩短反应的过程,节约资源,保护环境。

2.4 功能性磷脂的结构与组成分析方法

功能性磷脂是一种含磷酸的复合脂质,其分子结构是由甘油、磷酸以及脂肪酸结合的化合物[30]。它的化学结构通式为

图1 功能性磷脂的化学结构式FIg.1 Chemical structure of functional phospholipids

结构式中存在磷酸基团,R1和R2代表着不同脂肪酸组成,X基团则代表了功能性磷脂的不同种类。

功能性磷脂的种类繁多,甘油磷脂是最常见的功能性磷脂,包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)等以甘油为骨架构成的磷脂,功能性磷脂中的—X基团如表1所示

表1 功能性磷脂的种类Table 1 Types of functional phospholipids

在酶法合成功能性磷脂的基础上,目标产物的检测分析对控制目标产物的质量非常重要。目前,主要对功能性磷脂组成分析方法包括产物薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法及核磁共振等方法。

1) 薄层色谱法(TLC)

薄层色谱法又叫薄板层析,是利用各组成成分在某一物质中的吸附与溶解能力的不同差异,经过反复吸附与溶解的过程,使得各个目标成分都达到分离开。如郭勍等[31]利用硅胶薄层板将大豆磷脂组成成分分开,并对磷脂各个组成成分分析与含量的测定。薄层色谱法操作简单,使用方便,结果见效快,直接观察方便,特别适用于挥发性小的化学物质。对磷脂组成成分进行定性分析,对磷脂组成成分含量高低不太容易定量。

2) 高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱法又叫高分离度的液相色谱法,根据分离原理的不同可以分为液-液分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法等色谱法。分离磷脂的组成成分常采用的是液-液分配色谱法,其原理主要利用磷脂组分在流动相中的分配系数的大小来决定分离的顺序。Hanson等[32]利用NH2色谱柱、流动相以有机溶剂进行梯度分离洗脱,将蛋黄中的磷脂组成进行分离开来,对分离的组成成分进行定量定性的分析。高效液相色谱法能使PC、LPC、PE、LPE分离得完全与彻底。它的优势在于应用范围广,分析速度快,反复使用、样品不易破坏、易回收等,适用于沸点高,极性强,稳定性差的有机溶剂分离。

3) 气相色谱法(GC)

气相色谱法是指利用某些物质在高温下易挥发为气体但不会分解的特性,将其进行分离与分析的方法。气相色谱的作用主要在于测定化合物的纯度与分离各混合物的组成成分,根据原理可以分为吸附色谱与分配色谱2大类,前者的固定相主要是气-固,后者为气-液。气相色谱法可以用于酯交换反应合成功能性磷脂脂肪酸成分与含量的测定。如杨力会等[33]用脂肪酶催化甘三酯与磷脂酰胆碱酯交换的研究,通过气相色谱法对改性后亚麻酸磷脂的脂肪酸成分测定。气相色谱法具有分离效率高,速度快,灵敏度高,节约样品,选择性高,应用范围广等优势,缺点是在进行定性与定量分析时需要根据已知样品进行对比分析与校正。

4) 核磁共振法(NMR)

核磁共振技术的优势在于简便、成本相对较低、分析速度快等特点。对样品不需要进行甲酯化衍生化处理,而且核磁共振法分析脂肪酸组成的结果与气相色谱法是相似的,它是不会破坏样品的处理方式。应用于对油脂样品成分的分析,核磁共振氢谱是指根据样品化学结构中全部氢原子的信息,去计算脂肪酸在样品中的含量,可用于研究油脂的稳定性差异,鉴别油脂质量的好坏、分析油脂脂肪酸组成成分、探讨油脂氧化机理过程等方面,在对油脂脂肪酸组成及含量测定中,由于因为核磁共振氢谱峰强度与对应的氢原子数量存在线性关系。因此对于脂肪酸组成成分结果以摩尔百分含量表示。李添宝[34]利用核磁共振法定量分析植物油中多种脂肪酸组成含量。

近年来,对功能性磷脂组成成分检测分析达到了分子水平。但目前对磷脂分析还存在好多的困难,主要存在以下4个方面:1)不同生物样本中的磷脂缺乏一套标准的提取方法,会导致不同提取方法测定结果存在着偏差;2)针对磷脂异构体的分离仍存在很多困难;3)对磷脂组成分析的精准定量也难以实现;4)对于磷脂中微量成分发挥关键作用的测定也存在很大的困难。针对上述问题,研究一套标准化的磷脂提取和鉴定方法尤为必要,优化样品预处理技术、提高生物样品的分析与分离技术,增加质谱仪器性能等是今后对磷脂分析方法研究的主要方向。

2.5 功能性磷脂的生理作用

功能性磷脂是人体细胞的构成成分之一,对神经、生长、发育、代谢、激素等都有重要的影响,在医药与保健方面都有很大的价值。当代社会生活的节奏紧张与压抑,容易导致许多身体与心理的疾病,科学研究发现功能性磷脂能够作为一种预防各种疾病的保健食品,且其没有副作用,在疾病的预防方面有积极的作用[35]。它的生理作用主要有以下几个方面:

1) 对神经与大脑的发育有促进作用。功能性磷脂自身就是神经细胞与大脑的组成成分之一,研究发现长期服用它能够对精神异常者起到恢复作用,在作用过程中会转化为乙酰胆碱,对患者起到精神焕发的作用。如江波等[36]发现磷脂能够增强神经结构与大脑细胞生长旺盛,减慢它们的衰老与退化。因此,功能性磷脂具有延缓衰老,增强大脑发育的作用,还能预防神经性的疾病。

2) 对高血脂、高胆固醇、动脉硬化、心血管疾病有促进作用。功能性磷脂在人体内是生物膜的组成成分,会参与到脂肪和胆固醇的运输,能够加快代谢速率,减少脂肪与胆固醇的沉积。如崔洁等[37]研究发现DHA型磷脂能够降低肥胖小鼠脂肪与胆固醇的含量,将脂肪与胆固醇排出体外,维持体内的生理平衡。所以,功能性磷脂具有降血脂,预防高血脂、高胆固醇、动脉硬化、心血管等疾病的医用价值。

3) 对肝脏有积极作用。现如今,人们生活水平越来越高,经常性的饮酒与高脂肪的食物饮食,会导致各种肝功能破坏,引发各种疾病。功能性磷脂具有乳化作用,能够保护肝细胞不易损坏。如严玉澄等[38]研究磷脂能够提高细胞的活性和生长能力,提升身体各部分对疾病的抵抗功能。

4) 对调节心理方面有积极作用。近年来社会竞争激烈,人们会处在紧张与压力的环境下,会导致一些神经紊乱,出现焦虑、急躁、易怒、失眠等症状,长期在这种状态下人特别容易崩溃。经常食用功能性磷脂,能够补充营养物质,提高大脑细胞的活性,减少疲劳,提升身体机能,保持心情的愉悦。如何卓儒等[39]研究发现磷脂能起到修复凋亡因子与细胞的作用。

5) 具有活化细胞的作用。它是构成细胞膜的重要组成成分,对于细胞内外物质交换与吸收起着重大责任。人每天所消耗的功能性磷脂得不到充足的补给,细胞就会处于一种营养缺失状态,细胞能量就会减少,导致细胞失活。磷脂的来源必须从饮食中摄取足够量,如果缺少了磷脂,特别是三四十岁以后,人的肝脏细胞就会由于缺少磷脂,而导致快速衰老,还有是它可以加快人体神经细胞和大脑细胞之间的信息传递速度,主要由于它能增加包覆细胞薄膜的强度,使其不易受损,有利于乙酰基团进入细胞间隙与胆碱结合。如马婷等[40]研究罗非鱼头磷脂具有显著的抑制破骨前体细胞分化和促进破骨细胞凋亡的作用。

功能性磷脂的营养价值与生理功能还有待进一步的开发与研究。在未来随着以后对它的持续关注,不断完善它的提取,精制,制备的技术,能够使它在食品、医用、化妆品等行业中应用越来越广泛。

3 展 望

功能性磷脂有营养与生理作用的价值,未来将会有广阔的应用前景。近年来在食品、医药、化妆品方面对功能性磷脂产品的需求与日俱增,使得生产技术与制备方法不断取得突破,合成功能性磷脂的工艺条件趋于成熟与完善。随着磷脂的需求越来越多,从大豆和蛋黄中提取磷脂资源有限,也不能满足市场需求,寻找提取磷脂原料显得尤为重要,目前数量多、种类丰富、磷脂含量丰富的海产品能够作为未来提取磷脂的良好资源。酶促酯交换法由于反应速率快,专一性强,产物高等特性,未来仍然是研究的重点方向。生物技术的进步与发展将会为合成功能性磷脂提供了更多,更全面的发展前景,基因技术、发酵技术、酶工程等生物技术将会成为未来的主要研究方向。相信在人们的共同努力作用下,能够推动合成功能性磷脂的生产技术与制备方法的进步,未来功能性磷脂将以更高营养与生理作用价值应用在各行各业中,能够为人类的健康提供治疗与预防服务。