miR-222-3p靶向SOCS5促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

薄晓莉 哈丽亚·哈力木别克 潘 静 张清华 付晓雯 王建军

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其发生率和病死率常年居高不下[1，2]。尽管早期宫颈癌的筛查和治疗有助于挽救60%～90%患者的生命，但多数患者仍在晚期发现，导致其预后较差[3]。因此，阐明宫颈癌发生、发展的分子机制，有助于制定更好的治疗策略。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一类存在于生物体的非编码RNA分子，其长度约21～25个核苷酸[4]。miRNAs通过结合mRNAs的3′端非翻译区，调节蛋白表达，进而在多种生理和病理过程中发挥作用[5]。近期的一项研究显示，miR-222在宫颈癌中显著高表达[6]。miR-222是一种前体微小RNA，其成熟体miR-222-3p是在miR-222的3′端臂加工而来。然而，miR-222-3p在宫颈癌中的作用尚未见报道。本研究旨在明确miR-222-3p在宫颈癌细胞恶性生物学行为中的具体作用。

材料与方法

1.研究对象：5例宫颈癌患者来自于笔者医院妇产科，5例健康人来自笔者医院体检中心，其年龄、体重等指标均相匹配。受试对象均被告知本研究的目的，并签署知情同意书。涉及的操作遵照笔者医院医学伦理学委员会的相关规定。

2.细胞系：正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7、宫颈癌细胞系SiHa、人胚肾细胞HEK-293T均购自美国ATCC公司，保存于实验室。

3.试剂与仪器：胎牛血清FBS、DMEM培养基和高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)，miRNeasy Serum/Plasma试剂盒和miRNeasy Mini试剂盒(德国Qiagen公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司)，引物、miR-222-3p mimics、SOCS5过表达质粒、载有野生型SOCS5和突变型SOCS5的载体pGL3(中国生工公司)，Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)，CCK-8试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、小鼠抗GAPDH单克隆抗体和辣根过氧化物酶耦合二抗(中国碧云天公司)，Transwell小室(美国BD Biosciences公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，兔抗SOCS5多克隆抗体(美国Abcam公司)，荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，实时定量PCR仪、电泳仪、转膜仪、化学发光仪和酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

4.细胞培养：End1/E6E7细胞和SiHa细胞培养于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，HEK-293T细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基，隔天换液，在5% CO2、37℃条件下进行培养，当细胞密度达到80%时进行传代。

5.实时荧光定量PCR：血清微小RNA的提取用miRNeasy Serum/Plasma试剂盒，细胞微小RNA用miRNeasy Mini试剂盒提取，经反转录后获得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行实时荧光定量，程序设定为95℃10min，然后40个循环为95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s。U6作为微小RNA内参，采用2-ΔΔCT方法计算相对表达。Hsa-miR-222-3p：正向引物5′-GGGGAGCTACATCTGGCT-3′，反向引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。U6：正向引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

6.细胞活力测定：SiHa细胞接种于96孔板，每孔细胞数约6000个，将miR-222-3p mimics(1μl)、Notch1过表达质粒(1.2μl)，利用Lipofectamine 3000转染至SiHa细胞培养48h，然后更换培养基，每孔100μl培养基加入10μl CCK-8反应液，培养2h后于酶标仪测定，波长设定450nm。

7.细胞划痕实验：将转染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa细胞接种于6孔板，每孔细胞数约为密度约为2×105个，过夜培养后，用移液管尖端进行划痕，用无菌PBS轻轻洗去划下的细胞，加入无血清培养基常规培养，24h后进行拍照。

8.Transwell实验：将转染了miR-222-3p mimics、pcDNA3.1-SOCS5的SiHa细胞在无血清的培养基重悬，Transwell小室的上室接种约2×105个细胞，Transwell小室的下室倒入含血清的培养基。在细胞孵箱培养24h后，用甲醇固定下室细胞，并用0.5%结晶紫染色20min，然后在倒置显微镜下观察、拍照并计数。

9.荧光素酶报告基因实验：荧光素酶报告基因实验在HEK-293T细胞中进行。HEK-293T细胞接种于96孔板，约6000个/孔，将载有野生型SOCS5的pGL3(1μl)与miR-222-3p mimics(1μl)、载有突变型SOCS5的pGL3(1μl)与miR-222-3p mimics(1μl)、载有野生型SOCS5的pGL3(1μl)与mimics NC(1μl)、载有突变型SOCS5的pGL3(1μl)与mimics NC(1μl)分别利用Lipofectamine 3000共转染至HEK-293T细胞内，48h后用Bio-GloTMLuciferase Assay System检测，分析数值。

10.蛋白免疫印迹：收集SiHa细胞，用RIPA裂解，BCA法蛋白浓度定量；蛋白样品用SDS-PAGE凝胶分离，然后转至PVDF膜；PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2h；抗SOCS5和GAPDH一抗在4℃过夜孵育；TBST洗膜后，用辣根过氧化物酶耦合的二抗在室温孵育PVDF膜2h；ChemDocTMXRS+ System仪器检测目的条带，并用Image Lab软件进行灰度分析。

结 果

1.miR-222-3p在宫颈癌上调表达：分别取健康人血清和宫颈癌患者血清，检测miR-222-3p的表达水平，qRT-PCR的结果显示，患者血清的miR-222-3p显著增多(图1A，P=0.008)。此外，宫颈癌细胞系SiHa的miR-222-3p表达水平也显著高于正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7(P<0.01,图1B)。

图1 miR-222-3p在宫颈癌上调表达A.miR-222-3p在宫颈癌患者血清和健康对照组血清中的表达；B.miR-222-3p在正常宫颈上皮永生化细胞系End1/E6E7和宫颈癌细胞系SiHa中的表达

2.miR-222-3p促进宫颈癌细胞恶性表型：将miR-222-3p mimics转染至SiHa细胞，其增殖能力高于转染mimics NC的SiHa细胞(图2A)。进一步检测miR-222-3p mimics对SiHa细胞迁移能力的影响,细胞划痕实验的结果表明，miR-222-3p mimics促进SiHa细胞的迁移能力(图2B)。通过Transwell实验证实，miR-222-3p mimics增加SiHa细胞向Transwell下室侵袭的能力(图2C)。

图2 miR-222-3p促进SiHa细胞恶性生物学行为A.SiHa细胞转染miR-222-3p mimics和mimics NC后的细胞活力变化；B.细胞划痕实验验证miR-222-3p mimics对SiHa细胞迁移能力的影响；C.Transwell实验检测miR-31-5p mimics对SiHa细胞侵袭能力的影响;与mimics NC比较，*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

3.SOCS5是miR-222-3p的直接靶点：通过TargetScanHuman7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测发现，SOCS5是miR-222-3p的潜在靶点，而且其结合位点在脊椎动物中高度保守。荧光素酶报告基因实验证实，共转染野生型SOCS5和miR-222-3p mimics的荧光素酶活性显著减低(图3A)，表明SOCS5是miR-222-3p的直接靶点。蛋白免疫印迹实验表明，转染了miR-31-5p mimics的SiHa细胞的SOCS5蛋白水平显著下调(图3B)。为了证实SOCS5在miR-222-3p下游发挥作用，笔者进行如下实验。将SOCS5过表达质粒转染至SiHa细胞，SOCS5的蛋白表达水平显著升高(图3C)。CCK-8实验结果显示，共转染miR-222-3p mimics和SOCS5过表达质粒的SiHa细胞活力明显低于共转染miR-222-3p mimics和空质粒的SiHa细胞活力(图3C)。与之相一致的是，共转染miR-222-3p mimics和SOCS5过表达质粒的SiHa细胞的迁移能力和侵袭能力均低于共转染miR-222-3p mimics和空质粒的SiHa细胞(图3D和图3E)。

图3 SOCS5在miR-222-3p下游调节SiHa细胞的生物学行为A.荧光素酶报告基因实验验证SOCS5是miR-222-3p直接靶点；B.转染miR-222-3p mimics后SiHa细胞SOCS5的蛋白表达及灰度分析；C.共转染miR-222-3p mimics和SOCS5过表达质粒对SiHa细胞活力的影响；D.共转染miR-222-3p mimics和SOCS5过表达质粒对SiHa细胞迁移能力的影响；E.共转染miR-222-3p mimics和SOCS5过表达质粒对SiHa细胞侵袭能力的影响；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

讨 论

在全球范围内宫颈癌在女性恶性肿瘤中的发生率和病死率均排在第4位，在妇科相关恶性肿瘤中的发生率和病死率排在第2位，仅次于乳腺癌[1]。目前，早期筛查和疫苗的使用是预防宫颈癌发生和进展的重要手段[7，8]。尽管化疗和手术对部分宫颈癌患者有效，但严重的不良反应和并发症影响患者的生活质量和预后[9，10]。因此，阐明宫颈癌的发生、发展分子机制，有助于为患者提供更好的治疗策略。

属于非编码RNA分子的miRNAs尽管不具备编码蛋白的功能，却可以通过调控mRNAs特定区域而影响蛋白表达，从而在细胞的多种生物学行为中发挥重要作用[11]。越来越多的研究表明，miRNAs介导的蛋白表达异常是宫颈癌发病机制的重要环节。Lü等[12]研究发现，miR-664在宫颈癌患者显著低表达，过表达miR-664可以抑制c-Kit表达，进而诱导宫颈癌细胞凋亡增加。一项临床研究显示，miR-361-3p在宫颈癌样本中低表达，而且与患者不良预后显著相关[13]。除了下调表达，有些miRNAs在宫颈癌呈现显著高表达。Chen等[14]通过检测临床样本发现，miR-1246在宫颈癌患者显著上调，而且提示淋巴结转移的发生。进一步的细胞学研究表明，通过慢病毒介导的miR-1246下调可导致血小板反应蛋白-2的表达升高，从而促进宫颈癌细胞凋亡增加并抑制其增殖；小鼠荷瘤实验也证实miR-1246的下调有助于抑制瘤体增长[15]。这些研究提示，miRNAs的差异表达在宫颈癌中发挥截然不同的作用。本研究表明，miR-222-3p在宫颈癌高表达，并促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。此外，笔者发现SOCS5在miR-222-3p的下游发挥作用。

SOCS5是细胞因子信号转导抑制子SOCS家族成员之一，通过调节JAK-STAT信号通路在肿瘤细胞凋亡和增殖中发挥关键作用[16]。Zhang等[17]研究发现，抑制SOCS5可促进JAK-STAT3信号通路活化，从而增加胰腺癌的侵袭和转移。在急性T淋巴细胞性白血病中，沉默SOCS5的表达诱导JAK-STAT信号通路激活，促进疾病进展[18]。然而，SOCS家族成员在宫颈癌发病机制中的研究较少。国外的一项研究显示，SOCS1在宫颈癌组织中低表达或无表达[19]。与此结果相一致，Kim等[20]研究发现，SOCS1、SOCS3和SOCS5在宫颈癌组织和细胞系均呈现表达减少。但SOCS5在宫颈癌中的功能学研究尚未见报道。笔者发现，过表达SOCS5可抑制miR-222-3p对宫颈癌细胞的促增殖、促迁移和促侵袭作用。

综上所述，本研究通过体外实验证实miR-222-3p具有促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，而且其作用与抑制SOCS5表达有关。因此，这些结果初步提示miR-222-3p在宫颈癌的进展中发挥重要作用，为进一步明确其发病机制提供理论依据。