长链非编码RNA DSCAM-AS1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

陈 琦 陈 慧 池华茂 许文林

目前，乳腺癌是世界范围内的女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。中国乳腺癌的发病例数和死亡例数在世界范围内位居前列，晚期乳腺癌的形势更为严峻，5年生存率仅约20%[2，3]。基因的异常表达在乳腺癌发生、发展中起重要作用，多项研究证明长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 在基因转录前、转录水平及转录后调控中发挥重要作用，参与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等过程[4，5]。越来越多的研究者通过高通量测序技术建立lncRNA表达谱和数据库，寻找与乳腺癌进展相关的生物学标志物，为靶向治疗乳腺癌提供研究基础与理论依据。DSCAM-AS1被证实在肺腺癌组织中高表达，而在乳腺癌中报道较少。本研究通过检测DSCAM-AS1在乳腺癌患者组织中的表达情况，分析其表达水平与乳腺癌患者病理特征的关系，探讨DSCAM-AS1在乳腺癌进展中的作用，为发现诊断乳腺癌的新型分子标志物提供研究依据。

材料与方法

1. 标本资料:本研究所有样本来源于2016年9月～2017年9月就诊于江苏大学附属第四人民医院乳腺外科的乳腺癌患者，术前采集乳腺癌组织标本及癌旁组织60对，纳入标准：①所有术前未接受辅助放化疗，且术后病理证实为乳腺癌；②患者临床病理资料完整。排除标准：①术前接受过辅助放化疗的患者；②合并其他恶性肿瘤患者；③存在精神疾病患者；④合并有心脏、肺等脏器严重功能障碍的患者；⑤正在参与其他研究的患者。其中，浸润性导管癌43例，导管内癌12例，黏液癌5例，患者年龄41～80岁，>45岁患者45例，出现淋巴结转移38例，ER阳性患者42例，PR阳性患者27例，HER-2阳性患者34例，T1/T2期患者44例，T3/T4期患者16例，ki-67表达水平>10% 阳性患者41例。各分子分型luminal A型12 例，luminal B型23 例，HER-2阳性15 例，以及Basal-like 10例。

2.主要试剂:RNAiso试剂、SYBR Premix ExTaq Kit购自大连宝生物工程有限公司，lncRNA/mRNA RT-PCR Kit购自广州锐博生物公司。

3.标本处理:组织标本用PBS清洗后，剪切成适当大小分装于冻存管中，储存于-80℃冰箱备用。

4.RNA提取及qRT-PCR:样本直接按试剂盒的提取步骤进行总RNA提取，组织样本在液氮中研磨成粉末后，用RNAiso进行RNA的提取，按照lncRNA/mRNA RT-PCR Kit进行反转录反应，得到的cDNA保存于-20℃备用。引物由广州锐博生物公司设计并合成，DSCAM-AS1 上游引物: 5′-TGATATCCGGACACATGGTGA-3′，下游引物：5′-CTGCAAAAACGTGCTGAGAAT-3′。采用SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR扩增，检测荧光信号水平，20μl反应体系[2×SYBR Green 10μl, Primer (上游引物+下游引物)4μl，cDNA 2μl，ddH2O 4μl]，反应条件：预变性95℃ 30s，进行40个循环95℃ 5s，60℃ 34s，进行qPCR反应。采用2-ΔCT值计算癌组织及癌旁组织中DSCAM-AS1的相对表达量，每组设3个重复，实验重复3次。

5.生存曲线分析:采用Kaplan-MeierPlotter (http://kmplot.com/analysis/index. php?p=service & cancer=breast) 网站在线信息学分析数据库中的616例乳腺癌患者DSCAM-AS1的差异表达对其总体生存率的影响[6]。

结 果

1.DSCAM-AS1在乳腺癌及各分子分型组织中表达:乳腺癌组织中DSCAM-AS1的表达水平为0.473±0.073，高于癌旁组织 (0.057±0.008)，差异有统计学意义(t=5.667，P=0.000),详见图1。乳腺癌各分子分型之间DSCAM-AS1的表达存在差异 (F=7.053,P=0.000)，经两两比较，lumial A型、luminal B型以及Basal-like表型的组织中DSCAM-AS1的表达高于癌旁组织 (P=0.000)，而HER-2阳性表型的组织与癌旁组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图1 乳腺癌组织中DSCAM-AS1的表达情况

图2 乳腺癌组织各分子分型中DSCAM-AS1的表达水平与癌旁组织比较，*P=0.000

2.乳腺癌组织标本中DSCAM-AS1与临床特征的相关性分析：通过60例患者的病理参数进行分析，组织中DSCAM-AS1与淋巴结转移(χ2=5.275，P=0.022)，ER (χ2=4.775，P=0.029)、HER-2 (χ2=5.984，P=0.014)，TNM分期 (χ2=4.105，P=0.043)及ki-67 (χ2=6.213，P=0.013)的表达水平相关，ER阳性，HER-2阳性及ki-67阳性表达的组织中DSCAM-AS1的表达水平显著高于对应组，差异有统计学意义 (P<0.05),详见表1。

表1 组织中DSCAM-AS1的表达与临床病理特征的相关性

3.组织标本DSCAM-AS1表达水平的ROC曲线分析:组织中DSCAM-AS1的敏感度为56.7%，特异性为98.33%，曲线下面积为0.7517 (P=0.000)，详见图3。

图3 乳腺癌组织DSCAM-AS1的表达水平ROC曲线分析

4.DSCAM-AS1影响乳腺癌患者的总生存率：根据KM-plotter数据库分析结果，在大样本数据库中的616例乳腺癌中，高表达DSCAM-AS1 患者的总生存率降低 (P=0.18, HR=1.30)。进一步分析发现，在乳腺癌样本中的109例ER阳性的患者中，高表达的DSCAM-AS1的患者的总体生存率显著下调 (P=0.007, HR=2.88)，而在79例ER阴性的患者中，与低表达组比较，高表达DSCAM-AS1患者的总体生存率也出现下降 (P=0.12, HR=1.80)，详见图4。

讨 论

长链非编码RNA与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[7～10]。有研究者在综合数据库Gene Expression Omnibus (GEO) 和 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 中筛选出庞大数量的lncRNA，通过生物信息学和基因组数据分析研究这些lncRNAs的潜在生物学功能和表达调控，发现在乳腺癌中敲低lncRNA TINCR和HOTAIR，能够抑制肿瘤细胞的增殖，为乳腺癌中致癌lncRNA的研究提供了理论基础[11]。本研究前期通过基因芯片分析发现，DSCAM-AS1在乳腺癌敏感和耐药细胞株中出现差异表达，且在乳腺癌耐药细胞中表达显著下降。本研究发现，乳腺癌组织中DSCAM-AS1表达水平显著高于癌旁组织，且luminal A、luminal B，Basal-like表型的组织中DSCAM-AS1的表达高于癌旁组织，而HER-2阳性表型的组织与癌旁组织比较，差异无统计学意义，推测DSCAM-AS1在乳腺癌发生、发展中起重要作用。

图4 生物信息学分析DSCAM-AS1在乳腺癌组织中的生存曲线A.乳腺癌患者中DSCAM-AS1的总体生存率；B.ER阳性患者中DSCAM-AS1的总体生存率；C.ER阴性的患者中DSCAM-AS1的总体生存率

非编码RNA的表达水平与临床参数之间的相关性对诊断价值分析有着重要参考意义，本研究重点分析了DSCAM-AS1的表达水平与乳腺癌患者的临床病理参数之间的相关性。笔者发现，ER阳性的患者中DSCAM-AS1的表达水平高于ER阴性的患者，表明DSCAM-AS1与ER的表达存在相关性，DSCAM-AS1可能在ER调控的乳腺癌进展中发挥重要作用。笔者还发现T3/T4期乳腺癌患者中高表达DSCAM-AS1，表明DSCAM-AS1的表达水平与肿瘤的恶性程度相关，并且ki-67表达阳性的患者中DSCAM-AS1也出现高表达。乳腺癌血浆中HOTAIR表达水平与ER和淋巴结转移存在相关性，并且ROC曲线分析其敏感度和特异性均>70%，提示HOTAIR对乳腺癌有着极高的诊断价值，可以认为是乳腺癌诊治的分子标志物[12]。非编码RNA CCHE1在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织，与临床分期、淋巴结转移、HER-2表达水平有关，并且高表达的CCHE1组的中位PFS和OS都低于低表达组[13]。

DSCAM-AS1参与乳腺癌的功能调控的机制尚不清楚，马腾等[5]研究发现，DSCAM-AS1在肺腺癌组织中表达上调，可能参与线粒体功能调控导致氧化磷酸化水平的改变，导致线粒体功能相关基因的表达增加。lncRNA 主要通过转录前和转录后水平，通过调控基因表达及重要信号通路，影响肿瘤的进展、转移甚至预后[14,15]。有研究发现DSCAM-AS1在多种雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中高表达，且雌激素诱导下ER可以结合在DSCAM-AS1启动子区域，导致DSCAM-AS1表达升高，证明DSCAM-AS1与ER存在相关性[16]。何玉峰等[17]研究发现，乳腺癌骨转移患者雌激素受体、孕激素受体及人类表皮生长因子受体2的表达可应用于预测乳腺癌骨转移，同时单纯ER阳性的乳腺癌患者，相比较其他分子表型，最容易发生单纯骨转移，提示ER表达水平在乳腺癌的进展转移中起重要的作用。

有研究表明，高表达的DSCAM-AS1能够作为一个独立的预后不良因素，通过调控细胞周期的生长或停滞影响luminal型乳腺癌的内分泌治疗，影响患者的无病生存期[18]。它还能通过CeRNA机制促进细胞增殖，增加乳腺癌对他莫昔芬耐药[19]。因此，DSCAM-AS1可能在雌激素受体阳性的乳腺癌患者中，发挥着影响乳腺癌的进展及转移的重要作用，笔者通过生物信息学分析DSCAM-AS1的表达水平对乳腺癌患者总体生存率的影响，笔者发现高表达的DSCAM-AS1降低了ER阳性乳腺癌患者的生存率。本研究通过ROC曲线评价DSCAM-AS1针对乳腺癌的效能，笔者发现组织中DSCAM-AS1的表达水平在乳腺癌诊断中的价值较好，其曲线下面积均>0.5，且特异性较高。

目前，DSCAM-AS1在肿瘤中的报道较少，尤其在乳腺癌中的作用还未进行深入探讨，本研究发现其在乳腺癌组织中呈高表达，且与ER、肿瘤分期呈相关性，提示DSCAM-AS1在乳腺癌发生、发展中起重要作用，并在乳腺癌的诊断上有较高的价值。