茶多酚辅助植物乳杆菌FQR降解亚硝酸盐效应的研究

潘冬梅，吴怡瑾，王玉露，李海燕，梅 林

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036）

硝酸盐与亚硝酸盐广泛存在于食品中，具有发色、保持风味、抗氧化和抗菌等特性，在发酵肉制品生产中常被用作固化剂和防腐剂[1]。亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，能够引发高铁血红蛋白症[2]，在人体内与肠胃中的含氮化合物结合，形成致癌前体物质亚硝胺，亚硝胺具有强烈的致癌作用，能够引起食道癌、胃癌、肝癌和大肠癌等[3]，对人体健康造成严重的威胁，目前尚未找到能够完全代替亚硝酸盐的物质，亚硝酸盐仍是肉制品加工过程中的最佳选择[4]，因此对食品中亚硝酸盐和硝酸盐的控制以及降解极为重要。

亚硝酸盐的降解方法主要为生物、化学、物理降解[5]，其中生物降解法主要为亚硝酸盐降解发酵剂，具有高效、健康[6]、提升肉制品风味[7]的优势，是研究的热点。生物法最常用的发酵剂是乳酸菌，乳酸菌在代谢过程中能够产酸、酶以及其他物质，从而改变发酵环境[8]，达到高效降解亚硝酸盐以及生物胺的效果，如植物乳杆菌（Lactobacillus plan-tarum）PL-ZL001可以抑制香肠中6种生物胺的积累[9]；丁娟芳等[10]从扬州酱菜中筛选到能降解亚硝酸盐的高活性乳酸菌DGJ-17。而化学方法则主要是加入抗氧化剂，天然抗氧化剂包括维生素C（vitamin C，VC）、茶多酚（tea polyphenols，TPs）。茶多酚作为一种天然抗氧化剂，具有高效的抗氧化能力，并且具有一定的降解亚硝酸盐的效果[11]，王莹等[12-13]研究表明，茶多酚对微生物的作用具有选择性，它能够抑制致病菌，并且具有保护和促进有益菌生长的作用，促进双歧杆菌及乳酸菌的增殖，从而参与改善人体微生态，增强肠道的免疫功能。

本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）FQR作为研究对象，添加茶多酚辅助，以生物降解法结合化学降解法降解亚硝酸盐，对茶多酚辅助降解亚硝酸盐的条件进行了分析，为乳酸菌发酵食品中亚硝酸盐的降解提供一种方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）FQR：由本实验室保存[14]。

1.1.2 试剂

MRS肉汤（pH 6.2±0.2）、MRS琼脂培养基（pH 6.2）：杭州百思生物技术有限公司；茶多酚（纯度≥98.5%）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；亚硝酸钠、盐酸、四硼酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004型电子天平：上海上天精密仪器有限公司；Lambda 35紫外可见分光光度计：珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；TL-18M型高速冷冻离心机：上海市离心机研究所；DFE-20型精密pH计：梅特勒一托利多（上海）有限公司；HP-9012恒温培养箱、DHG-9030A恒温鼓风干燥箱：上海一恒有限公司；LX-B100L立式高压蒸汽灭菌锅：广州康迈医疗器械有限公司；SW-CJ-2SD超净工作台：上海巴玖实业有限公司；Eppendorf Researchplus移液枪：广州雷得生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化与保存

取保存好的菌株FQR接种于MRS肉汤培养基，37 ℃培养箱中培养，连续转接3次得活化菌株，将培养好的菌株于甘油冻存液中，-80 ℃保存。

1.3.2 茶多酚对菌株FQR生长的影响

分别向灭菌后的MRS肉汤培养液添加0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的茶多酚（经紫外照射灭菌30 min），以1%的接种量将菌株FQR接种于培养液，置于37 ℃条件下培养，在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时分别取100 μL菌液，稀释后涂布于MRS平板，37 ℃静置培养48 h，计数并记录实验结果。

1.3.3 茶多酚添加量对降解亚硝酸盐的影响

分别向灭菌后的MRS肉汤培养液中加入150 mg/L NaNO2以及不同含量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）的茶多酚，接种1%菌株FQR于培养液，置于37 ℃培养12 h，测定亚硝酸盐含量。

1.3.4 乳酸菌接种量对降解亚硝酸盐的影响

分别向灭菌后的MRS肉汤培养液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，对照组不加入茶多酚，分别接种1%、2%、3%、4%、5%的菌株FQR于培养液，置于37 ℃培养12 h，测定亚硝酸盐含量。

1.3.5 培养温度对降解亚硝酸盐的影响

分别向灭菌后的MRS肉汤培养液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，对照组不加入茶多酚，接种3%的菌株FQR于培养液，分别于29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃条件下培养12 h，测定亚硝酸盐含量。

1.3.6 pH对降解亚硝酸盐的影响

分别向灭菌后调节不同pH值（3、4、5、6、7）的MRS肉汤培养液中加入150 mg/L NaNO2以及0.3%的茶多酚，对照组不加入茶多酚，接种3%的菌株FQR于培养液，置于37 ℃培养12 h，测定亚硝酸盐含量。

1.3.7 亚硝酸盐含量的测定

按照参考文献[15-17]的方法测定亚硝酸盐含量。

1.3.8 数据处理与分析

每组每次至少3次重复，实验数据采用软件SPSS 24.0进行统计分析，方差分析采用ANOVA分析，多重比较采用Duncan法，P＜0.05表示差异显著，用Origin软件进行绘图。试验数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”来表示。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对植物乳杆菌FQR生长的影响

表1 茶多酚添加量对乳酸菌生长的影响Table 1 Effects of tea polyphenols additions on the growth of lactic acid bacteria CFU/mL

由表1可知，当茶多酚的添加量≤0.2%时，培养液中的菌落数呈现增长的趋势，茶多酚添加量为0.2%时，菌株FQR生长状况最佳，表明本研究中茶多酚的添加在一定范围内促进了菌株FQR的生长。蒋玉兰等[18]研究表明，茶多酚对植物乳杆菌具有增殖作用。王丽等[13]研究报道茶多酚有化学益生素的作用，对有害菌的增殖起抑制作用的同时能促进有益菌菌群的生长。表1中当茶多酚添加量达到0.5%时，菌落数生长情况与对照组相比基本持平，添加量0.6%后菌落生长情况开始被抑制，王莹[12]的研究中说明茶多酚分子中的众多酚羟基可与蛋白质分子中的氨基或者羧基结合，茶多酚与蛋白质之间的这种多点结合作用阻止细菌的侵染，从而使茶多酚具有抑菌作用，且其抑菌的能力与浓度有关。

2.2 茶多酚添加量对乳酸菌降解亚硝酸盐的影响

由图1可知，茶多酚添加量为0.1%～0.3%时，随着添加量增加，培养体系中亚硝酸盐降解率逐渐升高，与空白组的（73.92±1.17）%相比较，添加茶多酚后体系中亚硝酸盐降解率均显著提高（P＜0.05），茶多酚添加量为0.3%时亚硝酸盐清除效果最好，降解率达到（83.05±1.48）%，比未添加茶多酚组提高了12.35%。当茶多酚添加量增至0.4%时，培养液中的亚硝酸盐降解率为（81.19±0.94）%，与0.3%组相比较低且差异显著（P＜0.05）。

图1 茶多酚添加量对亚硝酸盐降解率的影响Fig.1 Effect of tea polyphenols addition on nitrite degradation rate

表1中茶多酚促进菌株FQR生长的最佳添加量是0.2%，而在亚硝酸盐加入后，清除亚硝酸盐效果最好的茶多酚添加量是0.3%而并非0.2%。这是因为在添加了亚硝酸盐的培养液中，茶多酚本身作为抗氧化剂具有一定的降解亚硝酸盐的作用[20-21]，此时培养液中不仅仅依靠菌株FQR产生的酸和被诱导后产生的亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐[22]，同时，茶多酚对培养液中的亚硝酸盐也起着降解的作用。

2.3 乳酸菌接种量对茶多酚辅助降解亚硝酸盐降解率的影响

图2 接种量对亚硝酸盐降解率的影响Fig.2 Effect of inoculum on nitrite degradation rate

由图2可知，添加茶多酚组的亚硝酸盐降解率均显著高于未添加组（P＜0.05），接种量为3%时清除效果最好，添加组为（89.09±0.63）%，比未添加组的（79.96±0.53）%提高了11.42%。接种量为1%～3%时降解率呈上升趋势，而当接种量＞3%之后两组均开始下降，这可能是因为接种量过大会造成培养液体系中的营养不足，导致菌株的生物量增长[23]，此时添加茶多酚组的清除效果仍比未添加组高。

2.4 培养温度对茶多酚辅助降解亚硝酸盐降解率的影响

图3 温度对亚硝酸盐降解率的影响Fig.3 Effect of temperature on nitrite degradation rate

由图3可知，添加茶多酚组的亚硝酸盐降解率均显著高于未添加茶多酚组（P＜0.05）。在29 ℃的条件下进行培养时，亚硝酸盐的降解率较低，这可能是因为乳酸菌在29 ℃条件下的生长状况较差，体系中仅有少量的菌和茶多酚对亚硝酸盐的降解起作用。随着培养温度的升高，亚硝酸盐降解率呈现先上升后下降的趋势，在37 ℃条件下，与未添加茶多酚组降解率[（78.24±0.28）%]相比，添加茶多酚组亚硝酸盐的降解率最高，为（88.23±0.59）%，提高了12.77%。

2.5 pH对茶多酚辅助降解亚硝酸盐降解率的影响

图4 pH对亚硝酸盐降解率的影响Fig.4 Effect of pH on nitrite degradation rate

由图4可知，pH为3～7时，添加茶多酚组的亚硝酸盐降解率均显著高于未添加茶多酚组（P＜0.05），说明茶多酚在5个不同pH的条件下都能够提高乳酸菌降解亚硝酸盐的降解能力。添加茶多酚组随着起始培养pH值的上升，亚硝酸盐降解率呈现先下降后上升再下降的趋势，pH为3时添加茶多酚组培养液中亚硝酸盐降解率较高，为（82.74±0.44）%，pH为4时降解率略降低，张庆芳等[24]研究表明，乳酸菌降解亚硝酸盐的机制分为酸降解和酶降解，当反应体系中pH值＜4.5时主要为酸降解，pH值＞4.5时主要为酶降解，因此pH值较低时亚硝酸盐降解率较高为正常现象。当pH为5时降解率最低，这可能是因为此时培养液pH条件既不适合乳酸菌的生长，又不能达到很好的降解亚硝酸盐的效果。pH为6时亚硝酸盐降解率最高，为（89.79±0.57）%，比未添加茶多酚组高10.80%。推测其原因可能是pH为6较适宜菌株FQR的生长代谢，能够产生较多的亚硝酸盐还原酶，从而提高了亚硝酸盐降解率。

3 结论

在一定添加量范围内，茶多酚能促进植物乳杆菌FQR的生长，添加量为0.2%时生长状况最佳。茶多酚的添加能够提高乳酸菌培养液中亚硝酸盐的降解率，由于茶多酚添加量过多时会抑制微生物的生长，因此添加量为0.3%时培养液中亚硝酸盐的降解率最高，比未添加茶多酚组提高了12.35%；进一步研究了不同培养条件对茶多酚辅助植物乳杆菌降解亚硝酸盐效应的影响，得出接种量为3%时，亚硝酸盐降解率最高，为（89.09±0.63）%；培养温度为37 ℃时，亚硝酸盐降解率最高，为（88.23±0.59）%；起始pH值为6时，亚硝酸盐降解率最高，为（89.79±0.57）%。

由此可知茶多酚的加入从两个方面影响了亚硝酸盐的降解，第一方面，茶多酚添加量在一定范围内时能够促进乳酸菌的生长，从而能够提升培养体系中乳酸菌的产酸以及产酶的能力，而乳酸菌对亚硝酸盐的降解就是由培养初期的酶作用和培养后期的酸作用而达到效果的；第二方面，茶多酚本身作为抗氧化剂能够通过催化亚硝酸盐的还原，进而具有一定的降解亚硝酸盐的能力。目前茶多酚已经开始广泛应用，通过添加少量的茶多酚提高乳酸菌降解亚硝酸盐的能力能够节约一定的成本，同时具有良好的降解效果。