miR-1-3p在食蟹猴心肌损伤中表达水平及其与CK-MB、cTnI和NT-proBNP的相关性

姜惠敏，惠汝太，汪巨峰

0 引言

药物致心脏毒性所引起的疾病即药物性心肌病，是临床医生用药的常见问题。虽然药物上市前经过非常严格的临床前和临床安全评价，但是仍有很多治疗性药物因引起未预见的心血管毒性反应被召回或停用[1]，故筛选一种或几种特异性药物性心肌病的生物学标志物，对于降低药物的死亡率和致残率，提高新药的临床前安全性评价具有重要意义。由于目前药物性心肌病常见的标志物肌钙蛋白、肌酐激酶等，存在“滞后性”、“特异性和敏感性”尚较差的问题[2-3]，因此，寻找和发现理想的药物致心脏毒性生物标志物，以便用来预测和发现药物致心脏毒性反应已势在必行。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一种包含19～25个核苷酸序列的高度保守非编码小RNA，其主要通过抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性发挥其生理作用[4]。目前，循环miRNA作为癌症、心肌损伤、肾脏损伤和肝脏损伤检测的潜在标志物已经得到初步验证并被认可，然而，在药物致心脏损伤中，循环miRNA作为生物学标志物的研究尚刚起步，其应用于临床前和临床药物的安全评价还需要进一步研究和定性[5-8]。miR-1在调控心脏发育和参与相关疾病发生过程中具有重要意义，是心脏特异性表达最高的miRNA之一[9-11]，多项研究表明，miR-1不仅在心血管系统发育、血管生成过程中发挥作用，而且参与了心肌梗死、心肌肥大、心肌纤维化和心脏重塑等病理过程[12-14]，但尚未检索到在药物致心脏毒性模型中miR-1表达相关文献。本研究通过给予食蟹猴静脉注射多柔比星造成心肌损伤模型，监测给予多柔比星的食蟹猴外周血循环中miR-1的变化，探讨其在药物致心脏毒性损伤诊断中的作用，以期为临床前和临床药物引起心脏毒性检测指标的应用提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 3～5岁普通级雄性食蟹猴(体重3.0～4.0 kg)17只，均购自北京协尔鑫生物科技有限公司[实验动物生产许可证号：SYXK(J2015-0027)]；采用Toxstat 2006软件，根据动物体重，按分层随机化分组法分为2组，对照组7只，静脉注射生理盐水2.5 ml/kg每周，连续4周；实验组10只，给予盐酸多柔比星注射液2.5 mg/kg每周(浙江海正药业股份有限公司，10 mg，批号:H44024359)，给药体积2.5 ml/kg，连续4周。动物金属笼单笼饲养，房间温度16～26 ℃，湿度40%～70%，换气次数8～10次/h，12 h照明，每天定量给食，自由摄食[实验动物使用许可证号：SCXK(J2015-0011)]。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及储存 血标本采集：4周后采集食蟹猴外周血浆标本2.5 ml(需隔夜禁食)，其中0.5 ml置于冰上预冷的EDTA抗凝离心管中，30 min之内4 ℃离心后分离血浆(3 000×g，10 min)；剩余2 ml血液，不抗凝，自然放置30 min后，离心后轻取上层血液，以上样本均放于-80 ℃冻存。心脏组织标本采集：处死食蟹猴取心脏后经液氮冻存和研钵磨碎或用组织匀浆器打碎后参照“1.2.2”项方法提取miRNA。

1.2.2 血浆及心脏组织中miR-1-3p的检测 使用TaqmanTMmirVanaTM-PARISTMKit(Life Technologies公司)进行抽提。简要步骤如下:取200 μl样品于1.5 ml无RNase的离心管中，加入800 μl的TRIZOL试剂，混匀，室温放置5 min；加入200 μl三氯甲烷，剧烈震荡15 s，室温静置5 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清于另一无RNase的离心管中，加入等体积的异戊醇，-20 ℃过夜；第2天4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，洗涤沉淀；弃上清，将沉淀晾干,加入30 μl的DEPC水溶解miRNA；按照miRcut miRNA cDNA第一链合成试剂盒操作获取cDNA[天根生化科技(北京)有限公司]；miRcut miRNA荧光定量检测试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]进行实时定量PCR实验。引物购自天根生化科技(北京)有限公司miRNA引物库，选用U6作为内参。逆转录引物序列如下:miR-1-3p-3p,53-uggaauguaaagaaguauguau-74′;U6，5′-CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3′。反应条件：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s，40个循环。实验数据使用ABI 7000软件进行分析，将ΔCt值作为样本表达量标准。

1.2.3 肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和N末端B型利钠肽前体(NT-proBNP)的检测 MILLIPLEX MAP Human CVD Panel 1(Cat. No. HCVD1MAG-67K，购自Merck millipore，内含CK-MB、cTnI、NT-proBNP检测)，严格按试剂盒说明书操作，并运用液态悬浮芯片系统(LuminexTM200，美国)进行参数指标检测和数据分析。

2 结果

2.1 食蟹猴心肌损伤模型的构建 由图1可见，与正常对照组相比较，静脉注射盐酸多柔比星注射液的食蟹猴，心肌细胞发生变性和脂肪空泡化，甚至部分心肌细胞发生坏死，并有大量炎性细胞浸润；且依据心脏组织病理学病变评分标准，提示模型建立成功。见图1、表1。

图1 食蟹猴心肌组织H&E染色

表1 食蟹猴静脉注射表柔比星心脏组织病理学检查结果

组织病理学改变对照组表柔比星(5 mg/kg)心脏空泡变性-(7/7)+(4/4)炎性细胞浸润-(7/7)-(3/4)++(1/4)心肌坏死+(1/4)

2.2 多柔比星对食蟹猴血浆中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平的影响 给予食蟹猴注射多柔比星4周后，血浆中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平与对照组相比升高，分别是对照组的3.1、10.67、3.47倍，且两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 多柔比星处理4周后食蟹猴血浆中CK-MB、cTnI、NT-proBNP浓度的变化(pg/L)

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3 多柔比星对食蟹猴血浆中miR-1-3p表达水平的影响 食蟹猴外周血血浆和心脏组织中miR-1-3p的表达水平在给药4周后均显著升高，分别是对照组的532.8%和237.5%，其表达水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 两组食蟹猴外周血浆和心脏组织中miR1相对表达水平

2.4 食蟹猴血浆中miR-1-3p的表达水平与CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相关性 通过对食蟹猴外周血浆中miR-1-3p的ΔCt值与cTnI、CK-MB和NT-proBNP的相关性进行分析，结果显示，药物致食蟹猴心脏损伤模型中，外周血浆中cTnI、CK-MB、NT-proBNP和miR-1-3p在给药4周后，表达水平均迅速升高，并具有明显相关性。见表3。

表3 血浆中miR1的ΔCt值与CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相关性分析

3 讨论

药物引起潜在的心脏毒性已引起世界各国药品监管部门、制药企业和临床医生的高度关注。目前因药物引起心脏毒性损伤而撤市和停止使用及导致患者死亡的概率，已经超越肝、肾毒性引起的脏器损伤，据中国卫生部药物不良反应监察中心推算结果显示，中国因药物不良反应相关疾病而入院的患者中，因心脏毒性造成的死亡率为5.16%。蒽环类抗生素是临床广泛应用的药物之一，其可引起不可逆心脏毒性，目前主要通过心脏功能指标进行心脏毒性的无创监测，尚无明确的早期血清学指标。

药物引起心脏毒性可能与氧化应激、钙超载、炎症反应、氧自由基引起的心肌损伤机制有关，目前比较成熟的标志物包括血浆酶学标志物(CK-MB等)、炎性反应标志物(CRP等)、心肌缺血坏死标志物(cTnT等)，有的敏感性较好而特异性欠佳，有的释放早，但出现的窗口期短。近年研究表明，miR-1在急性心肌梗死早期阶段表达升高，且与CK-MB等指标趋势一致[15]，研究发现，FABP3是miR-1调控的一个靶点[16]。食蟹猴是各项指标最接近人体的灵长类动物，但有关miR在药物所致心脏毒性损伤的食蟹猴外周血中的表达水平尚未见报道。

cTnI、CK-MB、NT-proBNP浓度均具有高度的心肌特异性[17]，在心肌受损的情况下逸出而导致血浆中浓度增高，是心肌损伤最特异和敏感的标志物之一，目前已较广泛应用于临床诊断。本研究观察了食蟹猴给药发生心肌损伤后血浆中cTnI、CK-MB和NT-proBNP蛋白的变化，结果发现，在心肌受损第4周，血浆中CK-MB、cTnI和NT-proBNP的含量均明显升高，验证了cTnI、CK-MB和NT-proBNP可作为药物致心脏损伤的生物学标志物。

Kuwabara等[18-19]研究发现，在不稳定型心绞痛患者的血浆中，miR-1的升高主要源于损伤的心肌细胞，且其表达水平上调与心肌的缺血应激相关，miR-1在缺血预适应对心肌的保护机制中起重要作用。本研究采用Real-time PCR法，测定给药4周后食蟹猴外周血浆中miR-1-3p的表达水平，发现实验组miR-1-3p的水平是对照组的532.8%，并推测血浆miR-1-3p表达水平升高的机制与缺血心肌细胞释放增加有关，心脏组织中miR-1-3p升高为对照组的237.5%，结合相关性分析结果，提示miR-1-3p有可能作为诊断和预测药物引起心肌损伤的潜在标志物。

综上所述，本研究结果证实，食蟹猴心肌损伤模型中，其外周血浆中的miR-1-3p表达量显著高于对照组，且血浆中miR-1-3p表达水平的变化与cTnI、CK-MB和NT-proBNP呈显著正相关，提示miR-1-3p在血浆中表达水平的变化有可能作为药物引起心肌损伤的分子标志物或联合检测标志物；且由于Real-time PCR法测定miR-1-3p简单易行，血浆无须特殊处理，有较好的临床应用前景。但该指标存在检测费用较高等问题，而且作为生物标志物，miR-1-3p评价药物引起心脏损伤的作用是否更优于现有的生物标志物如pro-BNP等，以及其在药物引起心脏毒性损伤过程中的具体作用机制尚不完全明确，这些都有待进一步研究的证实和大量数据进行验证。