HPLC法测定原料药AL58805中基因毒杂质

朱小华 吕列超 赵金亮 刘巧云 夏 玥 张 迪

(1.常州佳德医药科技有限公司，江苏 常州 213164；2.常州工程职业技术学院，江苏 常州 213164)

AL58805[1]是1类分子靶向抗肿瘤创新药物，已获得了国家食品药品监督管理总局颁发的临床试验批件(批件号2017L15180 和2017L05181)，目前已进入临床研究[2]。AL58805进入人体后，会选择特定的致癌位点来发挥作用，使肿瘤细胞产生特异性死亡，而不会波及周围的正常组织细胞。通过抑制肿瘤信号通路，对特定肿瘤有显著的治疗作用，为癌症患者带来了新的希望[3]。由于AL58805为对甲苯磺酸盐，在合成中使用了有机溶剂甲醇和乙醇，有可能会反应生成潜在基因毒杂质对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯[4]，因此建立对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的测定方法很有必要。

目前，对甲苯磺酸酯类的检测方法主要有高效液相色谱法[5]、液质联用法[6-8]、气质联用法[9-10]等。高效液相色谱法具有低成本、分离效率快、灵敏度高、适用于热不稳定化合物等优点。本研究建立了HPLC法测定AL58805原料药中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯含量的方法，可为该药有害杂质的检测提供参考。

AL58805制剂临床服药剂量约为150 mg·d-1，根据EMA《遗传毒性杂质限度指导原则》规定的限度，每人不能超过1.5 μg·d-1，则得到AL58805原料药中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的标准限度均为10 ppm[11]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器。

1.2 试剂

AL58805原料药(常州佳德医药科技有限公司，批号：20150501、20150601、20150701)；MPTS(对甲苯磺酸甲酯，阿拉丁，含量98.0%，批号E1528080)；EPTS(对甲苯磺酸乙酯，阿拉丁，含量98.0%，批号H1524007)；乙腈(色谱纯)；磷酸(分析纯)；氢氧化钠(分析纯)；水。

2 方法

2.1 色谱条件

InertSustain C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm)；流动相：0.015 mol·L-1磷酸水溶液-乙腈(50∶50，V/V)；检测波长为225 nm；流速为1 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；洗脱时间为18 min；溶剂为乙腈-水(50∶50，V/V)。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取MPTS对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为对MPTS贮备液。另精密称取EPTS对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为EPTS贮备液。分别精密量取MPTS、EPTS贮备液适量，加溶剂稀释制成每1 mL中约含MPTS、EPTS各10 μg的混合溶液作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量，加溶剂稀释制成每1 mL中约含MPTS、EPTS各100ng的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取AL58805原料药约100 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量溶剂溶解后，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至9，加溶剂稀释至刻度，摇匀，超声10 min，于0℃析晶30 min后，取出强力振摇，静置60 min后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

3 结果

3.1 波长选择

精密量取对照品贮备液20 μL注入液相色谱仪，在200～400 nm的波长范围进行PDA扫描。结果显示，MPTS和EPTS在225nm处有最大吸收，因此选择225 nm作为检测波长。

3.2 专属性试验

对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各取 20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，AL58805、MPTS、EPTS完全分离，保留时间分别为6.340、10.733、14.038 min，空白溶液对MPTS、EPTS的测定无干扰，说明本色谱条件专属性良好。

3.3 稳定性试验

精密量取新鲜制备的对照品溶液20 μL，分别于0、3、7、10、17、24 h 注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，MPTS、EPTS的RSD 分别为3.8%、3.7%。结果表明，对照品溶液24 h 内稳定性良好。

3.4 定量限和检测限

分别精密量取MPTS、EPTS贮备液适量，采用逐步稀释法，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录信噪比(S/N)约为10和3时的色谱图。测得MPTS、EPTS的定量限(S/N≈10)分别为9.960、13.64 ng·mL-1，检测限(S/N≈3)分别为3.320、4.550 ng·mL-1。

3.5 线性范围

精密量取MPTS贮备液适量，加溶剂稀释制成浓度分别为3.320、30、60、100、150、200 ng·mL-1的线性系列溶液；另精密量取EPTS贮备液适量，加溶剂稀释制成浓度分别为4.550、30、60、100、150、200 ng·mL-1的线性系列溶液；分别精密量取 20 μL注入液相色谱仪，记录MPTS、EPTS的峰面积。以浓度(ng·mL-1)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归。求得回归方程分别为MPTS:Y=0.0638X+0.0029，R2=0.9997；EPTS:Y=0.0623X+0.0456，R2=0.9992。线性范围分别为EPTS:3.320～200 ng·mL-1；MPTS:4.550～200 ng·mL-1。

3.6 精密度试验

3.6.1重复性

精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液0.10 mL，置10 mL量瓶中，共量取6份，加入已知MPTS、EPTS含量的待测原料药AL58805约100 mg，加适量溶剂溶解，按“2.2.2”项下处理，取续滤液作为重复性试验溶液。分别精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录MPTS、EPTS的峰面积。结果表明，MPTS、EPTS的回收率分别为105.8%、99.0%，RSD分别为1.2%、2.3%。

3.6.2中间精密度

更换仪器和日期，按“3.6.1”项下重新配制6份试样溶液进行检测。中间精密度与重复性试验12次结果表明，MPTS、EPTS的回收率分别为106.5%、92.5%，RSD分别为1.2%、7.6%。结果表明，该方法具有良好的精密度。

3.7 加样回收率

分别取已知MPTS、EPTS含量的原料药AL58805约100 mg，置10 mL量瓶中，依次加入“2.2.1”项下对照品贮备液0.07，0.10，0.13 mL各3份，加适量溶剂溶解，按“2.2.2”项下处理，制成低、中、高浓度的回收率溶液。精密量取各回收率试验溶液和对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录MPTS、EPTS的峰面积。计算MPTS、EPTS在供试品中的回收率分别为92.1% 、101.4%，RSD均为2.8%。结果见表1、表2。

3.8 耐用性试验

采用了“2.1”项下的方法，适量调整了色谱条件参数(柱温、流速、色谱柱品牌)，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，本法具有良好的耐用性。

表1 回收率试验结果(MPTS，n=9)

表2 回收率试验结果(EPTS，n=9)

3.9 样品含量测定

取AL58805原料药，按“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算AL58805原料药中MPTS、EPTS的含量。结果显示，三批供试品中均未检出MPTS、EPTS，图谱见图1。

A：对照品溶液，B：供试品溶液图1 典型色谱图Fig. 1 TypicalChromatograms

4 讨论

由于本方法中供试品浓度较高，故增加了样品前处理步骤(溶解、析晶、过滤等)，从而大大降低了进样溶液中供试品浓度，减少高浓度样品溶液对杂质测定的干扰。

综上所述，本文建立的采用HPLC法测定原料药AL58805中基因毒杂质对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯，方法具有成本低廉、灵敏度高，操作简单等优点，可以为原料药AL58805的质量标准的建立提供参考。