片球菌素的来源、生物合成、抑菌机理及其构效关系的研究进展

王祺，张军，乔晓妮，何增国,2*

1(中国海洋大学 医药学院，山东 青岛，266003) 2(青岛百奥安泰生物科技有限公司，山东 青岛，266100)

李斯特菌(Listeriaspp.)是一种导致食物腐败变质的常见微生物[1]。其中，单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)更会引起动物和人类的疾病[2]。据世界卫生组织统计，4%～8%的水产品、5%～10%的乳及乳制品以及30%以上的肉类被李斯特菌污染[3]。人和动物误食被该菌污染的食品后，会引起严重的食物中毒[4]。据报道，美国每年有1600多例单核增生李斯特菌感染人的病例，死亡率高达12.5%[5]。虽然四环素、甲氧苄啶和青霉素对治疗单核增生李斯特菌中毒的效果显著，但在食品工业中，仍然缺乏安全防止单核增生李斯特菌污染的有效手段[6]。

细菌素是一种来源于细菌的由核糖体合成具有抗菌功能的小肽，因具有安全性高、稳定性好、无残留等特点，在食品防腐领域日益受到关注[7]。乳酸菌是公认安全的(generally recognized as safe，GRAS)益生菌，其产生的细菌素更成为了食品防腐领域的研究热点[8]。其中，乳酸链球菌(Streptococcuslactis)代谢产生的细菌素——乳酸链球菌素(nisin)可有效地抑制腐败菌的生长、延长食品的保质期，已经在食品防腐领域应用达半个多世纪[9]。细菌素按照结构、分子量、热稳定性以及是否经过翻译后修饰等特点，主要分为3类(表1)。其中，IIa类细菌素也称类片球菌素，具有强烈的抗李斯特菌活性[10]，其中以片球菌素(pediocin)最具代表性。片球菌素具有良好的热稳定性和广泛的pH适应性，能够满足苛刻的食品加工环境，因此在食品防腐领域，特别是防止李斯特菌污染方面，成为了继nisin之后，细菌素研究领域又一热点[11]。

表1 细菌素的分类Table 1 Classification of bacteriocins

1 片球菌素的来源及序列特征

迄今为止，已发现的片球菌素共18个(表2)，来源包括：乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceous)和有害片球菌(Pediococcusdamnosus)。片球菌素分子质量一般在2～10 kDa之间，其序列中氨基酸残基数量差异较大，从37～48个不等(除前导肽外)，但其序列中均含有4个Cys，形成2对二硫键。如表2所示，片球菌素序列的净电荷数均为正值，这与其发挥抑菌功能直接相关。片球菌素一般在微克级别均有抑菌活性，且均表现出对单核增生李斯特菌具有强烈的抑制作用。

表2 片球菌素的种类及序列特征Table 2 Types and sequence characteristics of pediocin

续表2

名称来源氨基酸残基个数序列特征净电荷数敏感菌最小抑菌浓度分子质量/kDa参考文献pediocin 5Pediococcus acidi-lactici UL5-----[21]pediocin CP2Pediococcus acidi-lactici MTCC 5101---Listeria monocytogenesPseudomonas aeruginosa-3[22]pediocinPediococcus acidi-lactici 13-----5.5[23]pediocin JDPediococcus acidi-lactici JD123---Listeria monocytogenes--[24]pediocin PCPediococcus acidi-lactici PC---Listeria monocytogenes--[25]pediocinNCDC252Pediococcus acidi-lactici NCDC252--Listeria monocytogenesStaphylococcus aureus--[26]pediocinCFR B19Pediococcus pen-tosaceus CFR B19---Listeria monocytogenes-4.8[27]pediocin ST65ACCPediococcus pen-tosaceus ST65ACC---Listeria monocytogenes--[28]pediocinPP-SIIIPediococcus pen-tosaceus CFR SIII---Listeria monocytogenesSalmonella paratyphiStaphylococcus aureus-5[29]

2 片球菌素的生物合成

片球菌素的合成基因由质粒编码，其合成和分泌相关的4个基因位于同一操纵子[30]，包括：(1)结构基因(structural genes)，用于编码片球菌素前体；(2)免疫基因(immunity genes)，用于编码保护片球菌素产生菌免受其自身杀死的免疫蛋白；(3)ABC转运蛋白系统基因(ATP-bindingcassette transporter system genes)，用于编码与细胞膜相关的ABC转运蛋白系统，该系统将片球菌素转移到细胞膜上，同时去除片球菌素前体的前导序列；(4)辅助蛋白基因(accessory protein genes)，用于编码片球菌素分泌所必需的辅助蛋白。

与众多细菌素的合成类似，片球菌素的生物合成同样受群体感应(quorum sensing，QS)系统调控，主要表现在细菌素表达量与细胞密度或环境压力正相关[31]。这一过程受3组分系统调控[7]，即(1)诱导因子(inducer factor, IF)；(2)膜组氨酸蛋白激酶(member histidine protein kinase, MHK)；(3)响应调节因子(response regulator, RR)。首先，IF在基础水平上进行组成型表达，并通过ABC转运蛋白系统分泌到细胞外，当释放到细胞外的IF浓度足够高时，会结合到跨膜的MHK上，使其位于细胞质一侧自磷酸化。之后，这个磷酸基被转移到RR，并激活RR。最后，活化的RR与片球菌素结构基因上的启动子结合，启动片球菌素基因的表达。其中，IF在片球菌素生物合成过程作为正反馈因子，促进其自动调节机制(图1)。

图1 片球菌素的生物合成示意图(ChemBioDraw Ultra 14.0软件绘制) Fig.1 Schematic diagram of biosynthesis of pediocin(drawed by ChemBioDraw Ultra 14.0)

片球菌素基因表达的特点主要在于其N端有一段前导肽。该前导肽可使片球菌素前体与ABC转运蛋白系统有效互作。然后，在成熟的片球菌素分泌到胞外前，前导肽在细胞质侧被ABC转运蛋白系统的附属蛋白降解。此外，与其他细菌素的前体通常不具活性相比，连接前导肽片段的片球菌素前体具有明显的抑菌活性[32]。因此，为了避免片球菌素对产生菌的抑制作用，片球菌素合成后会被迅速运输到胞外(图1)。然而，前导肽的作用仅为辅助片球菌素分泌，对结构域的形成和抑菌功能的实现并没有作用。RAY等[32]将pediocin AcH前体肽和成熟肽分别进行异源表达，结果发现pediocin AcH前体肽的抑菌活性约为成熟肽的80%，这表明前导肽对pediocin AcH成熟结构域的形成和抑菌作用几乎没有影响。

3 片球菌素的抑菌机理

3.1 正确构象的形成

分泌到细胞外的片球菌素需要在特定环境条件下才能形成正确构型。研究发现，类片球菌素sakacin P在水或二甲基亚砜溶液中均以无规卷曲存在，不能正确折叠[33]。片球菌素正确折叠通常依赖于细胞膜或与细胞膜类似的环境。CASTANHO等[34]利用十二烷基磷酸胆碱(DPC)胶束和三氟乙醇(TFE)溶液模拟细胞膜环境，使用核磁共振波谱法分析2种类片球菌素在该环境下的三维结构，结果显示，N端形成含有二硫键的三股反平行β-折叠，同时C末端折回至中心α-螺旋上，形成含有发夹状结构的正确构型。这种受细胞膜或类细胞膜环境催化的折叠方式，拉近了带正电荷氨基酸残基的空间位置，为细菌素更好的与靶细胞膜结合提供了高效的构象基础。

3.2 N端与细胞膜的吸附结合

形成正确构型的片球菌素，通过N端β折叠结构域与目标菌株的细胞膜相互结合。首先，该结构域中带正电荷氨基酸残基通过非特异性的静电引力与靶细胞膜上带负电荷的磷脂基团相互作用，使片球菌素的亲水部分固定于细胞膜上[35]。因此，β折叠结构域带中正电荷氨基酸残基的聚集区越多，片球菌素对靶细胞膜的亲和力和结合力越强[36]；随后，该结构域与靶细胞膜上的甘露糖磷酸转移酶系统(mannose phosphotransferase system, man-PTS)结合，锚定在细胞膜上[37]。

3.3 C端向膜内插入

片球菌素锚定于细胞膜上后，其C端疏水性螺旋自然向细胞膜中间的疏水性区域插入，而C端区域插入的具体位置，由靶细胞膜上man-PTS的ⅡC和ⅡD亚基决定。首先，C端螺旋结构在片球菌素插入靶细胞膜时可作为跨膜组分起作用，即疏水螺旋穿入靶细胞膜的疏水核心。随后，特异性结合man-PTS的ⅡC和ⅡD亚基，导致细胞膜穿孔[38]。在膜穿孔过程中，片球菌素与II C亚基特异性结合形成片球菌素-II C复合物，而II D亚基起到稳定该复合物结构的作用。KJOS等[39]在大肠杆菌中对单核增生李斯特菌的man-PTS的ⅡC和ⅡD亚基进行异源表达后发现，ⅡC亚基单独表达时和ⅡC和ⅡD亚基共表达情况下，其对片球菌素敏感，且敏感性后者是前者的2倍，而当对ⅡD亚基单独表达时，大肠杆菌对片球菌素不敏感。因此，稳定的片球菌素-IIC复合物的形成，对片球菌素抑菌功能的实现起到至关重要的作用。

3.4 在细胞膜上穿孔形成孔洞

片球菌素在靶细胞膜上形成孔洞后，直接导致胞内钾离子、氨基酸等小分子物质外泄，使跨膜细胞质子动能势(proton-motive force, PMF)丧失。MANDAL等[2]利用800 AU/mL的pediocin NV5对单核增生李斯特菌处理30 min后发现，溶液中钾离子浓度提高7.5倍。然而，片球菌素作用于敏感细胞膜形成的孔洞直径较小，ATP和蛋白质等大分子物质会被截留在胞内，PMF的丧失加速了胞内ATP的消耗，导致细胞凋亡[40]。

4 片球菌素的构效关系

Ⅱa类细菌素是以片球菌素的结构为基础归类的，其一级结构通常包含37～48个氨基酸残基，亲水的阳离子N端区域含有1个保守的片球菌素框(pediocin box)区域，包含-YGNGV-基序[41-42]。二级结构中N端区域通常形成β-折叠结构域，C端结构域由1～2个α螺旋组成两亲性或疏水性结构。三级结构中C端通常以一个结构延伸的尾部折叠形成发夹状，在β折叠的N末端区域和发夹状C末端区域之间有1个柔性铰链，可使2个结构域之间实现相对移动[43]。大多数Ⅱa类细菌素N端均存在一对二硫键，对维持N端的两亲性结构和β折叠结构域的稳定具有重要作用(图2)。

图2 pediocin PA-1(PDB ID: 5UKZ)的三级结构(使用SPDV4.10软件生成) Fig.2 Tertiary structure of pediocin PA-1 (PDB ID: 5UKZ)

与Ⅱa类细菌素不同的是，片球菌素通常在其C端存在另一个二硫键，这使得片球菌素相对于其他Ⅱa类细菌素结构更加稳定[38-44]。FIMLAND等[45]发现，同为Ⅱa类细菌素，C端含二硫键的pediocin PA-1与C端不含二硫键的sakacin P相比，虽然在20 ℃的条件下抑菌活性相同，但在37 ℃条件下，前者的抑菌活性为后者的10倍。

4.1 C端区域

C末端α螺旋结构对片球菌素发挥抑菌功能起着决定性作用，因此对该区域序列中的关键氨基酸残基进行替代研究，可以有效提高片球菌素的抑菌功能。FIMLAND等[46]通过组合不同IIa类细菌素N端和C端区域，形成系列杂合细菌素。通过抑菌实验发现，C末端相同的杂合肽其抑菌功能大体相同，而N末端相同的杂合肽抑菌活性差异巨大；C末端的抑菌活性与其氨基酸残基组成直接相关。SUN等[47]通过对pediocin PA-1 C末端区域中8个氨基酸残基进行突变，结果显示，用疏水性氨基酸残基Ala取代第29位的Gly后，抑菌活性有非常明显的增加；HAUGEN等[48]利用带负电荷的氨基酸残基Asp替换pediocin PA-1 C末端一半螺旋区的片段中的所有残基，结果表明，第20位的Lys被替代后，片球菌素抑制活性有明显的降低。因此，疏水性和带正电荷的氨基酸残基，与C末端发挥抑菌作用直接相关。

4.2 N端区域

N端区域直接参与片球菌素与靶细胞膜结合。因此，对该区域序列中的关键氨基酸残基进行替代研究，可使片球菌素与靶细胞更有效的结合，而更高的结合效率通常意味着发挥抑菌作用需要的浓度更低。SONG等[49]对pediocin PA-1 N端正电荷氨基酸残基进行插入和替代研究，结果发现，将其N端第0位插入1个带正电荷的Lys，同时将第13位的Ser替换为Lys后，片球菌素突变体对靶细胞的亲和力升高，且对单核增生李斯特菌的抑菌浓度降低了50%，而在N端第10位的Gly替换为Lys后，片球菌素变体对靶细胞的亲和力降低，其抑菌浓度增加了10倍之多。因此，增加片球菌素N端特定位置带正电荷氨基酸残基，对其发挥抑菌功能具有提升作用。

4.3 ABC转运蛋白和辅助蛋白

ABC转运蛋白是保证片球菌素向胞外分泌的关键。该蛋白由约700个氨基酸残基组成，参与前导肽切割和成熟片球菌素向胞外分泌。因此，其结构稳定性对其发挥转运功能至关重要，二硫键通常具有维持蛋白结构稳定性的作用。OPPEGÅRD等[50]用Ser替代pediocin PA-1 ABC转运蛋白的Cys，结果显示pediocin PA-1向胞外的分泌被完全抑制。这表明ABC转运蛋白结构的稳定对其发挥转运片球菌素的功能至关重要。

片球菌素通常具有1～2对二硫键，辅助蛋白通常参与片球菌素二硫键的形成。辅助蛋白通常包含170个氨基酸残基，其N端依靠2个Cys形成的1对二硫键维持结构稳定。HAVARSTEIN等[51]分别用Ser替换pediocin PA-1辅助蛋白中的2个Cys，结果发现，取代第86位Cys后形成正确二硫键pediocin PA-1的数量减少到之前的1/2，而取代第83位Cys后形成正确二硫键连接的pediocin PA-1几乎完全消失。因此，辅助蛋白参与片球菌素二硫键的形成过程，同样依赖于其结构的稳定性。

5 展望

近年来，生物防腐剂受到了越来越多的关注[52]。片球菌素作为一种高效、安全、无毒、无残留的天然防腐剂，符合未来食品防腐领域的发展需求。片球菌素可强烈且专一抑制食物腐败菌——李斯特菌，其较窄的抗菌谱可能意味着更强的靶向性且对人体微生态的平衡影响更小。目前，已知的片球菌素产生菌均为GRAS菌，即公认的安全性菌种。片球菌素优良的热耐受性使其可被广泛的用于需经热处理的食品，而其广泛的pH耐受性，有效弥补了目前唯一商业化细菌素nisin仅存在于低pH值条件下的不足。片球菌素无毒、无色、无味，这些特点使其在食品领域发挥防腐作用的同时，不影响食物的风味，而蛋白属性又决定了其可被肠道内的胰蛋白酶等降解，因此不必担心残留和环境释放问题。未来，片球菌素作为食品添加剂大规模应用于食品工业，还有待于以下方面研究的进展：(1)高产片球菌素菌株的选育；(2)片球菌素专一性抑制李斯特菌机理的阐明；(3)利用分子手段，优化片球菌素序列结构，提高抗菌活性；(4)探索片球菌素在不同的食品加工环境和工艺下的应用效果。同时，开展片球菌素与其他防腐手段，如高流体静压或脉冲电场等协同作用的抑菌效果研究，也将拓宽其应用范围。相信随着相关研究的不断深入，片球菌素在食品领域，防止李斯特菌侵染方面将发挥重要的作用。