泰山白首乌中白首乌二苯酮在大鼠体内药代动力学研究

牛景梅 吕宝兴 赵进红 何文彬 李玉琴肖玉良

1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016； 2.泰安市泰山林业科学研究院，山东 泰安 271000

泰山白首乌(CynanchumbungeiDecne)，又称戟叶牛皮消，性微温，味甘、苦，无毒，临床上以块根入药，主要用于治疗久病虚弱、贫血、须发早白、慢性风痹、腰膝酸软、神经衰弱、痔疮、肠出血、阴虚久疟等症[1]。泰山白首乌因具有补肝肾、益精血、强筋骨、乌须发、延寿命之功效，具有药食同源性[2-3]。研究发现泰山白首乌含有C21甾体和苯乙酮类化合物、挥发油、多糖类及磷脂类化合物，另含有维生素、蛋白质、氨基酸和多种人体所需的微量元素等营养成分[4-6]，且其中的白首乌二苯酮等苯乙酮类化合物具有多种生理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗脑缺血损伤、神经细胞保护和抗衰老等[7-8]。近几年对于泰山白首乌中白首乌二苯酮等苯乙酮类化合物含量测定方法研究较多，对于其在体内代谢研究较少。因此，本项目拟建立测定大鼠血浆中白首乌二苯酮含量的HPLC法，并将此方法用于灌胃泰山白首乌提取液后大鼠体内白首乌二苯酮的药动学研究[9-10]，以阐明白首乌二苯酮在大鼠体内的药物代谢过程。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

依利特EC-2006液相色谱仪(大连依利特)、TG-16离心机(盐城凯特)、HP-5016SY氮吹仪(上海济成)；XW-80A涡旋仪、BJ-800A中药粉碎机。

白首乌二苯酮对照品(结构式见图1，由贵阳医学院李勇军教授赠送)，泰山白首乌采收于泰山林业科学研究院种植基地，并经泰山林业科学研究院庞宪伟研究员鉴定，自然晾干，色谱纯乙腈和甲醇，娃哈哈纯净水，肝素钠注射液(常州千红生物制药公司)，其他试剂均为分析纯。

清洁级SD雄性大鼠，体重(250±20)g，由山东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK-2014-0007。

图1 白首乌二苯酮

1.2 色谱条件

Agilent ZORBAX-C18柱(4.6×250 mm，5μm)，乙腈-0.2%甲酸溶液(30∶70)为流动相，流速1.0 mL/min，紫外检测(λ=260 nm)，于室温进样20 μL测定。

1.3 实验方法

1.3.1白首乌二苯酮(1.0 mg/m L)储备液 精密称取白首乌二苯酮对照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，置于4℃冰箱中冷藏，备用。

1.3.2泰山白首乌提取液的制备 精密称取50.0 g泰山白首乌粉末(过三号筛)，按1∶25料液比加入70%乙醇，加热回流2 h，趁热过滤，滤液用0.22 μm膜进一步过滤后，于旋转蒸发仪中旋蒸成浸膏，加生理盐水配制成25 mL的泰山白首乌提取液。

1.3.3空白血浆制备 取健康雄性SD大鼠5只，禁食不禁水12 h后，采用心脏取血并置于肝素化EP管中，3 500 r/min离心10 min，取5只大鼠血浆混合制成空白血浆。

1.3.4血浆样品处理 于200 μL血浆中加入800 μL乙酸乙酯，涡旋混匀1 min后，12 000 r/min离心10 min，转移出上清液，并用氮气吹干，残留物中加100 μL甲醇，涡旋复溶1 min，将此溶液过 0.22 μm膜，备用。

2 结果与讨论

2.1 血浆蛋白沉淀剂的优化

在进行血浆中白首乌二苯酮含量测定前，首先要去除血浆蛋白的干扰。依据白首乌二苯酮的溶解性，分别考察了甲醇、乙腈、流动相沉淀蛋白法和乙酸乙酯萃取法。结果表明，甲醇或乙腈沉淀蛋白后的提取液，内源性杂质峰较多；而乙酸乙酯萃取处理所得提取液，干扰峰少，故将乙酸乙酯萃取法作为处理血浆蛋白的方法。

2.2 流动相的优化

如图1所示，白首乌二苯酮分子结构中含有多个酚羟基，采用乙腈-水(30∶70)为流动相时，由于酚羟基的解离出现峰拖尾现象，加入甲酸可抑制酚羟基的电离，进而改善峰拖尾现象。为了获得对称的峰形，固定乙腈和甲酸溶液的比例为30∶70，进一步优化了流动相中甲酸的浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)。当流动相中甲酸的浓度为0.2%时，可得对称的白首乌二苯酮峰，保留时间约为11 min，故选择乙腈-0.2%甲酸溶液(30∶70)为流动相。

2.3 专属性考察

将200 μL空白血浆、100 μL空白血浆+100 μL白首乌二苯酮对照品溶液(100 μg/mL)、大鼠灌胃给药泰山白首乌提取液0.5 h的200 μL血浆，按“1.3.4”项下的方法萃取处理，照“1.2”项下的色谱条件， 3份萃取液的色谱图见图2。如图2所示，内源性物质对白首乌二苯酮的测定无干扰，方法具有良好的专属性。

a,空白血浆；b,空白血浆+白首乌二苯酮；c,含药大鼠血浆。

图2 白首乌二苯酮HPLC色谱图

2.4 标准曲线绘制

取200 μL大鼠空白血浆6份，分别加入100 μL用甲醇稀释制备的5、25、50、100、200、300 μg/mL的白首乌二苯酮工作液，按“1.3.4”项下所述的方法萃取处理后，照“1.2”项下的色谱条件测定萃取液中白首乌二苯酮的峰面积，峰面积的测定结果Y与浓度C(μg/mL)的回归方程为Y= 13.865C-59.487，R2= 0.9966。因此，白首乌二苯酮在5～300 μg/mL的浓度范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度考察

取3份200 μL大鼠空白血浆，在其中分别加入10、50、150 μg/mL白首乌二苯酮工作液100 μL，按“1.3.4”项下的方法萃取处理后，照“1.2”项下的色谱条件，分别测定3份萃取液中白首乌二苯酮的峰面积，测得日内峰面积的精密度为3.4%；将这3份萃取液置于4℃冰箱中保存，并连续测定5天，测得日间峰面积精密度为5.8%。白首乌二苯酮峰面积的日内和日间精密度均小于15%，符合体内药物分析方法验证的相关规定。

2.6 提取回收率考察

照“1.2”项下色谱条件，分别测定5、50、150 μg/mL白首乌二苯酮工作液中白首乌二苯酮的峰面积。取3份200 μL的空白血浆，分别精密加入5、50、150 μg/mL的白首乌二苯酮工作液100 μL，按“1.3.4”项下的方法萃取处理后，照“1.2”项下色谱条件，测定萃取液中白首乌二苯酮的峰面积，提取回收率=萃取液中白首乌二苯酮的峰面积/对照品溶液中白首乌二苯酮的峰面积(表1)。由表1可见，低、中、高浓度的提取回收率在81.15%～82.34%，均大于50%，符合体内药物分析方法的要求。

表1 大鼠血浆中白首乌二苯酮回收率考察

2.7 稳定性考察

在3份200 μL的空白血浆中，分别精密加入10、50、200 μg/mL的白首乌二苯酮对照品溶液100 μL，按“1.3.4”项下的方法萃取处理后，将萃取液置于4℃冰箱中，并照“1.2”项下的色谱条件，分别于2、4、8、12、24、48 h测得白首乌二苯酮峰面积的RSD=4.8%，表明在48 h内制备的血浆样品稳定。

2.8 重复性考察

取大鼠空白血浆200 μL，精密加入100 μL白首乌二苯酮工作液(100 μg/mL)，平行制备6份，按“1.3.4”项下的方法萃取处理，照“1.2”项下色谱条件，分别测定6份萃取液中白首乌二苯酮的峰面积，峰面积的RSD= 6.1%，表明重复性良好。

2.9 大鼠体内白首乌二苯酮的药代动力学研究

6只健康雄性SD大鼠，给药前12 h禁食不禁水。灌胃生药量为20 g/kg的泰山白首乌提取物，给药后分别于0.08、0.17、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h眼内眦取血0.5 mL，将血样置于肝素化离心管中，离心(3 500 r/min×10 min)后，取上清液200 μL，照“1.3.4”项下方法萃取处理后，制备的样品按“1.2”项下条件测定白首乌二苯酮的峰面积，并带入“2.4”项下的直线方程计算血药浓度，将测得的药-时数据导入DAS 2.0软件拟合处理，所得的药动学参数见表2，相应的药-时曲线见图3。

图3 白首乌二苯酮血药浓度-时间曲线

表2 白首乌二苯酮的药动学参数

结果表明，在大鼠体内白首乌二苯酮的药代动力学过程符合二室模型。达峰时间Tmax为0.25 h，表明其在大鼠体内吸收速度快，达峰时间短，且达峰浓度高(249.5 μg/mL)；T1/2α小于T1/2β，表明在体内分布较快，主要以消除为主，AUC(0-t)=715.642 μg/(mL·h)较高，表明白首乌二苯酮在大鼠体内吸收较好。

3 结 论

本研究建立了大鼠血浆中白首乌二苯酮的HPLC测定方法，该方法专属性强、重复性好、准确度高，可用于大鼠血浆中白首乌二苯酮的含量测定。利用该法研究了泰山白首乌中白首乌二苯酮在大鼠体内的药代动力学，结果显示白首乌二苯酮在大鼠体内的药动学模型为二室模型，达峰时间0.25 h，达峰浓度 249.46 μg/mL，且T1/2α小于T1/2β，表明在体内分布较快，主要以消除为主。