正交设计法优选美白复方中药提取工艺及体外抗氧化活性研究

钱春喜 齐祥秋 孙玉娣 于晨庆 王清华 张春平 段静雨

徐州医科大学药学院/江苏省新药研究与临床药学重点实验室, 江苏 徐州 221004

中国女性对美白的追求历史悠久，美白类护肤品已成为功效性护肤品的重要组成部分[1]。传统的人工合成小分子化合物如曲酸、烟酰胺、对苯二酚等虽具抗氧化和美白功效，但使用过程中常出现过敏、不耐受、刺激等诸多问题[2]，而从天然植物资源中提取美白活性成分更显绿色安全，已成为护肤品研发领域的热点。美白机制的核心是抑制皮肤黑色素的生成，其中既催化羟化反应又参与氧化反应的酪氨酸酶，是黑色素形成过程中的限速酶[3]。因此，可通过抑制酪氨酸酶活性和清除自由基抗氧化的方式来减少黑色素形成，同时根据传统中医理论，选择具有行气活血的中药，通过纾解郁结、气血互补、促进代谢，亦可减少黑色素生成获得美白功效[4]。现代科学研究发现，甘草、桑白皮、怀山药、白芍和芦荟具有良好的酪氨酸酶抑制活性和自由基清除作用[5-8]，本研究将上述5种中药组成复方，采用正交设计法，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率作为美白活性评价指标，筛选最佳提取工艺，为新型中药美白妆品的开发提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 UV752紫外分光光度计(上海精科分析仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HWS24型水浴锅(西安禾普生物科技有限公司)；电子天平(上海精科分析仪器厂)。

1.2 试剂 0.1 mol/L盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)；无水乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司)；磷酸氢二钠(上海凌峰化学试剂有限公司)；磷酸二氢钠(上海凌峰化学试剂有限公司)；DPPH(1,1-Dipheyl-2-picrylhydrazyl radicle，1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)(日本和光纯药工业株式会社，批号：ALE1299)；1380 U/mg酪氨酸酶(25 KU)(美国Worthington试剂公司，批号：E608BD0304)；L-多巴胺(上海伊卡生物技术有限公司，批号：E118BA0025)；甘草(批号：020116296)、桑白皮(批号：020116126)、怀山药(批号：020116324和白芍(批号：020116193)均为安徽尚德中药饮片有限公司生产，芦荟(批号：020114443，厂家：安徽孟氏中药饮片有限公司)。

2 方法与结果

2.1 美白复方中药的提取 称取甘草5 g，桑白皮5 g，白芍5 g，山药5 g，芦荟提取物1 g，备用。依据单因素实验原理，选取乙醇体积分数、料液比、提取次数和提取时间四个因素，在此基础上开展正交设计实验L9(34)。采用加热回流提取，提取液蒸发浓缩至15 mL，用无水乙醇稀释浓缩液制得供试药液21 mL(约相当于原生药1 g/mL)，备用。

2.2 美白活性评价

2.2.1 酪氨酸酶抑制率的测定

2.2.1.1 溶液的配制 ①磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 准确称取磷酸氢二钠7.16 g和磷酸二氢钠3.12 g，加去离子水充分溶解，分别转移至100 mL量瓶中定容配制成0.2 mol/L的溶液，以51∶49的比例混合均匀，pH调至6.8，即得。

②酪氨酸酶溶液的配制 精密称取一定量的酪氨酸酶(1380 U/mg)，用PBS溶解配成200 U/mg的酶液，-20 ℃保存，用前于4 ℃解冻。

③多巴溶液的配制 精密称取L-多巴胺0.15 g，加0.1 moL/L的盐酸溶液预溶，待完全溶解，加PBS 100 mL稀释配制1.5 g/L多巴溶液，4 ℃避光保存。

④样品溶液的配制 用PBS将供试药液稀释，使反应体系中药液的终浓度为1 mg/mL。

2.2.1.2 测定方法 参考文献[9]按照表1，在各试管中分别加入PBS、样品溶液和酪氨酸酶溶液，混合均匀，于恒温水浴(37℃)反应10 min，分别迅速加入多巴溶液1mL，充分混匀，水浴反应5 min，取出后立即于475 nm处测定各反应液的吸光度AC1、AC2、AT1、AT2。平行试验3次，按公式(1)计算供试药液的酪氨酸酶抑制率。

酪氨酸酶抑制率=(1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2))×100%

(1)

2.2.2 DPPH自由基清除率的测定

2.2.2.1 溶液的配制 ①DPPH溶液的配制 精密称取DPPH 0.0197 g，加无水乙醇定容至50 mL作为储备液，4 ℃避光保存。精密移取储备液10 mL，无水乙醇稀释至100 mL，得100 μmol/L的DPPH溶液，4 ℃避光保存备用。

②样品溶液的配制 精密量取供试药液0.5 mL，无水乙醇稀释至50 mL，得样品溶液(相当于原生药浓度10 mg/mL)。

2.2.2.2 测定方法 参考文献[10]按照表2，在各试管中加入对应溶液，混合均匀，避光反应30 min，于517 nm处分别测定吸光度A0、A1、A2。平行试验3次，按公式(2)计算供试药液DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

2.3 单因素试验考察美白活性中药的提取工艺 选取乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数4个因素，各因素设置 4个不同水平，研究各因素最佳范围，优化提取工艺。根据文献[11]，综合酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，设置权重为7∶3定义美白度，作为评价优化美白中药复方提取工艺的指标。美白度综合评分按公式(3)计算。

美白度综合评分=酪氨酸酶抑制率× 0.7+DPPH自由基清除率×0.3

(3)

2.3.1 乙醇体积分数对提取物美白功效的影响 设置乙醇体积分数为40 %、60 %、80 %和95 % ，分别回流提取1次，每次1 h，料液比1∶7，测定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度综合评分分别为56.69%、57.59%、58.02%和69.89%，表明95%乙醇提取美白活性最佳。

2.3.2 料液比对提取物美白功效的影响 设置料液比为1∶6、1∶7、1∶8 和1∶10，用95%乙醇分别回流提取1次，每次1 h，测定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度综合评分分别为66.04%、65.57%、48.75%和64.18%，表明料液比1∶6提取美白活性最佳。

2.3.3 提取次数对提取物美白功效的影响 设置提取次数为1、2、3和4，用95%乙醇分别回流提取1 h，料液比1∶6，测定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度综合评分分别为 67.95%、54.66%、48.9%和48.24%，表明提取1次美白活性最佳。

2.3.4 提取时间对提取物美白功效的影响 设置提取时间为1、1.5、2和3 h ，用95%乙醇分别回流提取1 次，料液比1∶6，测定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度综合评分分别为54.99 %、43.51 %、59.95 %和57.03 %,表明提取2 h 美白活性最佳。

2.4 正交试验 以单因素试验为基础，对乙醇体积分数、料液比、提取时间及提取次数进行L9(34)正交试验。分别按下表3进行试验，结果及极差分析见表4，方差分析见表5。

表3 因素水平

表4 L9(34)正交试验设计与结果

表5 方差分析

由表4的极差结果可知，各因素对提取物美白活性影响顺序为A(乙醇体积分数)>B(料液比)>C(提取时间)>D(提取次数)。依据试验结果，美白组合物最佳提取工艺为 A2B2C2D1，即乙醇体积分数为 80%，料液比1∶7，提取2 h，提取 1次。按上述提取工艺进行3批药材的验证试验，提取物美白度综合评分分别为84.34%、83.88%、84.76%，RSD为0.52%，证明本提取工艺稳定可靠，且所得提取物美白活性较高。

3 讨论

本研究筛选出5种具有优良美白活性的中药，即甘草中有效成分甘草黄酮具有抑制酪氨酸酶的活性、抑制多巴色素互变异构酶的活性及阻止吲哚-5、6-醌的聚合，可有效抑制黑色素生成；桑白皮提取物具有显著的清除超氧阴离子自由基和OH自由基的功效，减少黑色素形成的内在因素，怀山药为酪氨酸酶抑制剂，与甘草协同抑制酪氨酸酶活性，增强美白功效；芦荟可吸收紫外线，是一种优良的天然防晒剂，减弱黑色素形成的外在条件；白芍具有促进皮肤血液循环和活血养颜的功效[5-8]；故将上述中药配伍使用，作用于黑色素形成的不同环节，协同增效，以实现全方位美白的护肤理念。

本研究以酪氨酸酶抑制率和DPPH 自由基清除率作为指标评价复方中药的美白活性。因美白提取物可抑制酪氨酸酶活性导致其催化反应的有色产物多巴醌生成减少，于475 nm 处测量吸光度间接反映美白提取物对酪氨酸酶的抑制活性[12]。当提取物中抗氧化成分加至DPPH 自由基溶液，其孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，于517 nm 处测定吸光度间接反映提取物抗氧化能力[13]。此法测定时间短、操作简便、适于对美白活性成分的大范围初筛。

4 结论

合理复配筛选出的5种中草药，在单因素试验的基础上采用正交设计，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率为综合评价指标，优化美白复方中药醇提工艺为乙醇体积分数 80 %，料液比1∶7 ，提取2 h，提取 1次，以此工艺制得提取物美白度平均84.33%。本研究将抑制黑色素形成和清除自由基抗氧化等途径有机结合，充分贯彻中药多成分、多靶点、多机制的协同作用理念指导开发中药美白妆品，为中药资源在化妆品领域的研发提供参考。