雨生红球藻中虾青素检测方法综述

王书妍，孟迎迎，薛 松

（1.内蒙古民族大学 化学与材料学院，内蒙古 通辽 028043；2.中国科学院 大连化学物理研究所 海洋生物工程组，辽宁 大连 116023；3.大连理工大学 环境与生命科学学院，辽宁 大连 116024）

虾青素，化学命名为3，3’-二羟基-β，β’-胡萝卜素-4，4’-二酮，属于酮式类胡萝卜素.研究表明，虾青素为自然界最强的抗氧化剂［1-2］.虾青素具有抗氧化性、抗辐射、抗衰老、抗肿瘤及防治心血管疾病等功能［2-3］，因此具有极高的经济价值，已应用于保健品、药品、饲料添加剂、化妆品、功能食品、食品添加剂等方面［4］.虾青素生产的原料主要来自虾蟹壳［3，5］、雨生红球藻［4］及红法夫酵母［6］中，其中雨生红球藻中在胁迫条件下可积累虾青素达到干重的5%.由于虾青素结构中有两个手性C 原子，雨生红球藻中的结构为3S，3S’构型，而合成的为手性混合物，以3R，3R’构型为主，雨生红球藻被认为是天然虾青素生产的最佳来源.

雨生红球藻在胁迫后形成胶壳状外壁，细胞内色素提取时，常规的溶剂很难进入细胞内部将色素萃出，通常需要结合破壁方法.其次，雨生红球藻细胞内虾青素主要以虾青素酯的形式存在，即不同酰基链结合的虾青素单酯分子、虾青素双酯分子，存在HPLC分析难以对其所有分子达到基线分离，且含量计算时分子量的不同.另外，虾青素在光热等条件下不稳定易发生降解，因此，造成虾青素的准确测定存在一定问题.本文从雨生红球藻中虾青素的提取、水解及检测等方面对目前的研究状况进行了综述，以期能够指导基于不同目的的快速测定雨生红球藻中虾青素的含量选择合适的方法提供指导.

1 雨生红球藻中虾青素的提取

虾青素的提取是准确测定其含量的基础，也是虾青素测不准的环节之一.胁迫条件下雨生红球藻细胞虾青素积累，但细胞生长及分裂停止，形成不动孢子即胶壳细胞.成熟的胶壳细胞具有三层厚、硬的细胞壁，最外层为胶鞘（Algaenan），一种强抗醋酸水解的材料.第二、三层分别为均匀和非均匀分布的甘露糖和纤维素［7］.对于具有胶壳外壁的雨生红球藻，常规的溶解提取法无法进入细胞内部将色素萃出.目前在工业中对于雨生红球藻中虾青素采用超临界CO2萃取技术［7］、高压/超高压均质提取技术［8］、负压空化法［9］等.上述几种方法可有效提取虾青素，但需要藻粉量大，操作复杂，适合大规模的工业生产.应用于雨生红球藻中虾青素检测的提取方式包括溶剂提取法、机械研磨+溶剂提取法、二甲基亚砜（DMSO）浸提法以及纤维素酶破壁+溶剂提取法.

1.1 溶剂提取法

溶剂浸提法操作简便、成本低、对设备要求低，只需对提取溶剂、料液比、提取温度、提取时间进行优化即可.常用的溶剂有丙酮［10］，乙酸乙酯、二氯甲烷及乙醇等.但由于雨生红球藻胶壳外壁，常规溶剂并不能进入细胞，虾青素的提取率较低.Mendes-Pinto等报道了丙酮作为雨生红球藻中虾青素的提取溶剂，提取率仅为4 mg·g-（1每克藻粉提取虾青素质量），而机械破碎+丙酮提取率为19 mg·g-1，说明溶剂并不能进入细胞内，将虾青素提取出来［10］.

Ruen-ngam比较了利用超声辅助提取（Ultrasound Assisted Extraction）、微波辅助溶剂萃取（Microwave Assisted Extraction）、索式提取（Soxhlet Extraction）等辅助的溶剂提取法，其中微波辅助提取75 °C 5 min，虾青素提取率达到74%［11］.此外，为增强溶剂的提取效率，化学破壁即利用酸或碱对雨生红球藻细胞进行处理，Sarada等报道了利用浓度为2 mol·L-1的盐酸溶液70 °C处理2 min，后利用溶剂进行提取，虾青素的提取率可达86%～94%［12］.但值得注意的是将虾青素置于高浓度的酸或碱溶液极易造成虾青素的降解.上述的结果说明由于雨生红球藻特殊的细胞壁组成，直接溶剂浸提无法进入细胞，而辅助的超声、微波及酸碱处理均易造成虾青素的降解，并不适合用于虾青素的提取.

1.2 机械破壁+溶剂提取

机械破壁是利用外力将雨生红球藻细胞壁破碎，是实验室最常用的破壁方式.雨生红球藻中虾青素检测的国标GB/T 31520-2015中［13］，将雨生红球藻利用玻璃匀浆器充分研磨，二氯甲烷-甲醇为溶剂对其色素进行提取.机械破碎+溶剂的提取方法在虾青素的检测中应用较多［10，14-16］.机械破碎能够将细胞壁破损，其色素可达到完全提取，方法操作简单，但此方法需要将每个样品通过细胞匀浆器进行研磨，耗时、费力.

1.3 纤维素酶破壁+溶剂提取

由于雨生红球藻细胞壁主要为纤维素、果胶、脂多糖等物质组成，因此纤维素酶、果胶酶和多糖酶等应用于雨生红球藻的破壁处理［8］.周锦珂等探索了酶法提取雨生红球藻中虾青素的新工艺［17］.纤维素酶对藻粉进行酶解处理，乙醇提取.酶解法提取的最佳工艺条件为：酶解液初始pH值4.5、酶解温度45 °C、酶用量1.5%、酶解时间15 h.在此条件下虾青素的提取率达94.6%，比传统的乙醇直接提取法高61.5%.具有操作温度低、污染少、成本低、提取率高等方面的优点，易于实现绿色工业化生产，但此方法耗时较长，且高温也易造成虾青素的降解.

1.4 DMSO浸提法

DMSO与各种溶剂均具有良好的互溶性，另外具有对细胞的良好的渗透性，常用于药物或农药的渗透促进剂，及细胞冻存过程中的保护剂.Seely 首次报道了DMSO 可用于微藻叶绿素及类胡萝卜素的提取［18］.Boussiba等利用DMSO对雨生红球藻中的色素进行提取，70 °C水浴提取10 min，重复提取2～3次藻渣可达到无色［19］，说明DMSO良好的渗透性，可渗透进入雨生红球藻细胞，将虾青素完全提取出来.DMSO提取无需对雨生红球藻的细胞壁进行处理，大大简化了虾青素提取的过程，已在虾青素的检测中得到应用［20-21］.此外，世界微藻领军企业Cyanotech 公司、日本Fuji 公司以及中国绿A 生物工程公司［8］等均对DMSO提取雨生红球藻中虾青素的方法应用于虾青素的检测中.

利用DMSO作为溶胀剂，能够增大细胞壁的通透性，可以作为雨生红球藻虾青素的提取剂，简化的雨生红球藻检测中需要破壁的过程.

2 虾青素酯的水解

雨生红球藻中所积累的虾青素为全反式3S，3S’构型，末端环状结构中各有一个羟基，通常与C16、C18或C20脂肪酸酯化形成虾青素酯，以稳定其结构［22］.其中大部分为虾青素单酯，约占75%，虾青素双酯约占20%，而游离虾青素仅占5%［12，23］.雨生红球藻中虾青素单酯及双酯分子数高达30种［24］，虾青素酯的复杂性使得虾青素纯化和直接准确定量存在问题造成，因此需要将提取的虾青素酯水解成游离虾青素，实现单一物质的纯化和HPLC准确定量.通常虾青素酯水解的方式有皂化和酶解两种方法.

2.1 皂化法

皂化一般在NaOH或KOH甲醇溶液进行反应，将虾青素酯水解为游离虾青素.Yuan等的研究指出皂化过程中高的碱浓度或反应温度有利于虾青素酯的水解反应的进行，同时也加剧了虾青素的降解［14］.陈兴才等的研究也显示游离虾青素的浓度随着碱浓度的增加直线下降［25］.Yuan等研究虾青素酯皂化下的水解动力学及不同碱浓度下虾青素的降解，结果显示在22 °C 反应体系中NaOH 浓度为0.0175～0.020 mol·L-1时，虾青素酯可水解完全，且不会发生虾青素降解，而更高浓度的NaOH-甲醇溶液或反应温度则会引起虾青素的明显降解［26］.虾青素酯皂化方法的条件苛刻，皂化过程中碱溶液的浓度，皂化温度及时间均会影响皂化的效率及虾青素的稳定性，也是影响虾青素的准确测定的另一个环节.

2.2 酶解法

Zhao报道了一种来自圆弧青菌（Penicillium cyclopium）水溶性碱性酯酶能够将虾青素酯转化为虾青素，反应条件为28 °C搅拌下孵化7 h，虾青素的回收率达到63.2%［27］，但此酶酶解效率低，并未在虾青素含量的测定中得到广泛应用.而Jacobs 首次报道了脂溶性胆固醇酯酶可以快速将类胡萝卜素酯进行水解［28］.目前虽然文献对此酶解方法的研究报道较少，但酶解法作为一种温和的水解方式被生产虾青素的国内外公司应用，所使用的胆固醇酯酶不仅能够完全水解虾青素酯，且不易造成虾青素的氧化，可以更加准确的确定虾青素的含量.

利用胆固醇酯酶对雨生红球藻含虾青素的提取物时间短，大幅提高雨生红球藻中虾青素的检测效率.

3 雨生红球藻中虾青素的定量检测

虾青素的检测方法主要有分光光度法、水解-HPLC法、HPLC-MS法.

3.1 分光光度法

Boussiba报道利用5%KOH-30%甲醇溶液加热10 min左右破坏雨生红球藻叶绿素，然后DMSO提取虾青素，波长475 nm 测定其吸光度值以计算虾青素浓度.此方法能够快速估算虾青素含量，在培养及生产中应用较多［12，29］.但有报道显示此方法中碱溶液破坏叶绿素的处理，造成虾青素25%～40%的降解［16］.因此Li等对Boussiba的方法进行了改进，不经碱液处理直接由DMSO进行提取，可见光530 nm波长进行检测，避免了其他类胡萝卜素及叶绿素干扰，应用于雨生红球藻中虾青素含量的快速检测［16］.耿金峰等的研究显示雨生红球藻在培养过程中体内所含的类胡萝卜素含量与虾青素含量是呈稳定的线性关系，使用直接较容易的测定类胡萝卜素，间接获得虾青素含量的方法，可快速测定出类胡萝卜素的含量，再根据所得的类胡萝卜素和虾青素的相关性，可快速推算出雨生红球藻体内虾青素的含量.本实验室的数据也显示基于分光光度法测定的类胡萝卜素与经酶解-HPLC 测定的虾青素的含量具有良好的线性（图1）.因此，可以直接利用DMSO提取，利用分光光度法在475 nm下测定，利用图1的关系即可获得准确的虾青素的含量.

分光光度法可作为雨生红球藻培养过程中虾青素监控的快速检测手段.

3.2 水解-HPLC法

雨生红球藻提取色素经皂化或酶解前处理后，HPLC 可对游离虾青素进行准确测定.目前虾青素测定的国标GB/T 31520-2015采用皂化后HPLC测定的方法［13］，分离色谱柱为反相C30柱，20 min可完成皂化后全反式游离虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素的检测.Yuan利用C18柱对虾青素酯皂化后产物进行分析，甲醇/二氯甲烷/乙腈/水作为流动相梯度洗脱，16 min 完成单样检测［30］.而Cyanotech 公司雨生红球藻含量测定方法为将提取色素酶解后进行HPLC测定.这种经水解前处理将虾青素酯转变为虾青素可把含有虾青素化合物的混合成分转变为检测虾青素单一成分，使HPLC分析更加简单，能够准确定量，重复性高.更多虾青素反相色谱分离条件总结于表1中.

3.3 HPLC-MS法

由于提取虾青素及其酯衍生物的多样性及复杂性，常规的分光光度法及HPLC法并不能识别不同虾青素酯分子间的差别，质谱利用虾青素酯分子间质量及碎片信息的差别能够较好的分辨不同的分子，进而进行定性及定量分析.提取的色素样品不经处理直接HPLC/MS的测定方法，避免了皂化过程中虾青素的降解，可实现虾青素、虾青素酯分子、其他类胡萝卜素及叶绿素的同时测定，在虾青素成分确定及虾青素代谢机理研究中具有一定应用.Holtin等利用LC-（APCI）MS对雨生红球藻中游离虾青素异构体、虾青素单酯、虾青素双酯及叶黄素进行了定性分析［24］.Weesepoel 等利用ESI-IT及MADIL-TOF/TOF 对雨生红球藻中的虾青素酯进行了更加细致的分析，包括虾青素酯酰基链的确定，及顺反异构体的区分［32］.更多虾青素及其酯衍生物的色谱分离总结于表1中.值得注意的是类胡萝卜素及虾青素酯的低极性，常用的软电离ESI离子源难以将其离子化，APCI离子源较多的应用于虾青素酯的分析.

本文通过对目前雨生红球藻中虾青素的提取、水解及检测方法进行了综述与评估，DMSO溶剂提取后直接进行分光光度法在波长475 nm下进行检测，根据分光光度法测定类胡萝卜素含量与HPLC法虾青素含量的线性关系快速计算虾青素含量.此方法更利于快速获得研究过程中的相关重要参数.而DMSO提取后，胆固醇酯酶进行水解，HPLC 测定游离虾青素的含量，可作为准确测定虾青素含量的方法.对于不同的检测目的，可以采用不同的方法进行分析，而不同实验室或方法间的数据比较，应该要把数据矫正到提取样品的水解处理，HPLC分析之后的结果进行分析.

表1 文献报道的虾青素的HPLC及HPLC-MS测定条件Tab.1 The measurement conditions of astaxanthin by HPLC and HPLC-MS reported in the literature