头风颗粒对偏头痛模型脑膜组织形态及中脑导水管周围灰质c-fos、c-jun基因表达的影响

于明秀，吕文学，署文杰，孙西庆

(山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

偏头痛是一种反复发作的神经功能障碍性疾病，主要表现为一侧或双侧搏动性的剧烈头痛，有发作性、搏动性的特点，发作时生活和工作能力下降，严重危害患者身心健康。中医药治疗偏头痛已有几千年历史，积累了丰富的临床经验。经多年的临床实践，孙西庆教授用头风汤治疗偏头痛临床疗效显著[1]，头风汤由加味二陈汤加减创制而成，具有清热燥湿之功效。本课题研究中，将头风汤做颗粒制剂，复制了偏头痛大鼠模型，研究头风颗粒对偏头痛大鼠脑膜组织及中脑导水管周围灰质c-fos、c-jun mRNA表达的影响，探究偏头痛发病机制，探讨头风颗粒预防和治疗偏头痛的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，体重200～250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001，合格证号0055920。

1.1.2 主要药剂与仪器 头风颗粒(山东中医药大学附属医院药学部提供中药材，制剂室加工制为散剂)；硝酸甘油注射液(5 mg/mL，北京益民药业有限公司，国药准字 H11020289，产品批号20160906)；10%水合氯醛溶液(鲁药准字 H01080291，产品批号：20161201)；0.9%氯化钠注射液(500 mL：4.5 g，华仁药业有限公司，国药准字 H37021260，产品批号160806H2)；PBS缓冲液(0.01 M，pH=7.2～7.4，山东省医科院实验中心配制)；RNA逆转录试剂盒和SyBRGreen qPCR Master Mix试剂盒(invitrogen生物技术公司)，引物为上海生工合成；兔抗大鼠c-fos、c-jun抗体购自abcom公司；DAB显色试剂盒剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.1.3 主要实验器材 脑立体定位仪(深圳瑞沃德(Reward)公司)；大鼠冠状面脑模具(深圳瑞沃德(Reward)公司)；全自动组织脱水机(德国Lica公司，Asp300型)；石蜡组织包埋机，(德国Lica公司，EG1160型)；恒冷箱切片机(德国Lica公司，CM1850型)；超低温冰箱(日本三洋公司)；光学显微镜(德国Leica公司)；超净工作台(苏州苏洁净化设备公司)；微量加样枪(德国Eppendorf公司)；低温离心机(德国Eppendorf公司)；Milipore超纯水机(法国Milipore公司)；Roche LightCycler 480II PCR仪(德国罗氏公司)；Nano Drop 2000超微量分光光度计(Thermo公司)；Leica DM480图像分析系等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药 120只SD大鼠在相同条件下适应性喂养1周，随机分为正常对照组、模型组、头风颗粒治疗组和头风颗粒预防组，每组各30只。给予模型组、头风颗粒治疗组和头风颗粒预防组大鼠造模，建立实验性偏头痛动物模型，方法为皮下注射硝酸甘油注射剂，剂量按体重10 mg/kg；正常对照组皮下注射等量的生理盐水。造模30 min后，给予模型组大鼠灌胃蒸馏水，剂量按体重1.04 mL/kg；给予头风颗粒治疗组大鼠灌胃头风颗粒，剂量按体重1.04 mg/kg；在建立模型前给予头风颗粒预防组大鼠灌胃头风颗粒1周，剂量按体重1.04 mg/kg。

1.2.2 模型制备 大鼠称重，以10 mg/kg计算GTN用量，皮下注射GTN诱发偏头痛模型，造模成功判定：造模后5～10 min，大鼠即出现双耳发红、爬笼次数增多、前肢频繁挠头、烦躁不安等现象，约30～60 min达高峰，持续约3 h后，大鼠呈现活动减少、蜷卧状态。

数据分析采用GraphPad Prism5软件统计分析并作图，计量资料以均数±标准差(±s)表示，各组之间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

在构建学习共同体时，应该遵循“组内异质，组间同质”的原则，以学习者特征分析数据为依据，以促进沟通交流为目的，从而为课堂活动的顺利展开打下基础。

1.2.5 实时荧光定量PCR(Rt-PCR) ①解剖学定位取材：取材过程中为保证每只动物的取材位置在PAG的相同位置，应用了脑模具和前囟标记的方法，以此保证取材尽可能是在相同位点。快速取出大鼠中脑PAG。(备注：3只动物的PAG作为一个样品)。②总RNA提取：采用TRIzol法提取各组总RNA，抽取获得的RNA经鉴定及定量分析后，进行反转录合成cDNA，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5min。取2ulcDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：变性 95 ℃ 10s、退火60 ℃ 30s、延伸72 ℃ 10s，共40个循环。实时荧光定量PCR法(Rt-PCR)检测PAG中c-fos和c-jun mRNA的表达，以β-actin为内参。c-fos上游引物为5′-GAGGGAGCTGACAGATACGC-3′，下游引物为5′-CTCGGGGTAGGTGAAGACAAA-3′；c-jun的上游引物为5′-CGTTCCTCCAGTCCGAGA-3′，下游引物为5′-AAGTTGCTGAGGTTGGCG-3′；β-actin上游引物为5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3′，下游引物为5′-TACAGCCCGGGGAGCATCGT-3′。③实验数据的标准化：在qRT-PCR反应结束之后，得到各个标本组织的表达Ct值，Ct值为反应实时荧光强度达到设定阈值所经过的扩增循环数，扩增呈现对数增长，与组织标本的起始拷贝数呈现反比。样本△Ct=待测基因Ct的平均值-参照基因Ct的平均值。采用2(-△△Ct)法计算得出相对表达量。

1.2.4 脑膜组织形态观察 将脑膜从颅骨上分离，苏木素-伊红(HE)染色观察各组脑膜组织形态。

肉食要减少。我国近十年肠癌和乳腺癌发病率上升很快，这些癌症都属于“西方型肿瘤”，主要原因就在于肉食过多，身体中摄入过多脂肪和热量，导致胆汁酸和牛黄胆酸等过多、内分泌失调而诱发肿瘤。另外，治未病很重要的是戒烟、限酒。

除正常对照组外，其余三组大鼠均造模后5～10 min开始出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多、烦躁不安的现象，均在31～60 min达到高峰。大约60 min后头风颗粒治疗组和预防组的动物活动逐渐减少，90 min后模型组动物活动开始减少，90～120 min及120～150 min时间段治疗组、预防组挠头次数与模型组比较，减少明显。150 min后头风颗粒治疗组和预防组大鼠逐渐趋于正常。模型组大鼠上述现象持续时间较长，持续约3 h，大鼠活动逐渐减少。

1.2.3 标本制备 常温下，用10%水合氯醛3.5 mL/kg对大鼠进行腹腔麻醉，充分放血后，超净工作台冰上迅速断头，取部分系着脑膜的颅骨放入4%多聚甲醛(4 ℃)中备用。然后完整取出鼠脑，迅速剥离出中脑导水管周围灰质，放入1.5 mL灭菌的离心管，标记后置于液氮内冷冻保存。

偏头痛的发作与多种因素有关，包括遗传、饮食、内分泌以及精神因素等，其发病机制至今尚未明了，较为公认的有三叉神经血管学说、皮层扩散性抑制学说。近年来研究较多的是三叉神经血管学说[2]，该学说概括偏头痛的发病机制为以下三个方面：脑膜血管扩张、神经源性炎症形成、中枢神经元功能异常[3-4]。偏头痛动物模型种类较多，其设计原理均是根据偏头痛发病机制而来，应用较广泛的为硝酸甘油型偏头痛动物模型。硝酸甘油型偏头痛模型属于神经血管反射机制模型，此模型操作技术简单，实验动物经济、易于获得，模型症状与偏头痛临床症状相似性好，造模因素单一稳定，可在短期内大量复制[5]。本项目中，采集硝酸甘油型偏头痛模型中脑导水管周围灰质(PAG)标本，通过苏木素-伊红(HE)染色，观察各组大鼠脑膜组织形态。结果发现，与正常组比较，模型组大鼠脑膜毛细血管扩张明显，血浆蛋白外渗，血管周围肥大细胞脱颗粒，大量炎性细胞渗出，这些现象也证实了皮下注射硝酸甘油可引起脑膜毛细血管扩张、神经源性炎症形成，给药干预组较模型组上述现象明显减轻，可见头风颗粒能显著减轻硝酸甘油引起的神经性炎症。

1.3 统计学处理

作为与医学相关联的学科，药学教育的目标是培养从事药物研发和药学服务的专业人才。目前世界多国为加强药学生的职业责任感，均采用了宣誓仪式。

2 结果

2.1 大鼠症状行为学变化

中国在维和行动中的领导决策能力尚未得到有效体现。在当今世界，国际规则往往由一些发达国家制定，在国际安全领域的联合国维和行动也不例外，很多情况下，维和人员派遣国无法充分参与维和行动各阶段的所有工作。一些国家（其中大部分为发展中国家）提供了大部分维和人员，却很少有机会参与维和决策，他们提供的一些有价值的意见也很少被采纳。中国作为参与国，因受种种因素的限制，在维和行动中很难起到主导作用。

2.2 大鼠脑膜组织形态学观察

显微镜下可见c-fos、c-jun免疫反应阳性的神经元细胞呈棕黄色，主要分布在PAG区，尤其在PAG的腹外侧区，且呈双侧对称分布(镜检图片见图5-12，200X)。正常对照组大鼠PAG区可见一定阳性细胞，偏头痛模型组大鼠PAG区c-fos和 c-jun阳性细胞数明显增多，与正常对照组比较有显著统计学差异(P<0.01)；与偏头痛模型组比较，头风颗粒治疗组和预防组c-fos和c-jun阳性细胞数明显减少，有显著统计学差异(P<0.01)。见表1。

图1 正常组

图2 模型组

图3 预防组

图4 治疗组

2.3 头风颗粒对偏头痛模型大鼠PAG区c-fos、c-jun mRNA表达的影响

应用 real-time PCR方法检测各组大鼠中脑导水管周围灰质的c-fos、c-jun mRNA的表达。c-fos、c-jun mRNA相对表达量，以正常对照组为1，各组大鼠PAG区c-fos mRNA相对表达量见图5，各组大鼠PAG区c-jun mRNA相对表达量见图6。与正常对照组相比，偏头痛模型组大鼠PAG区c-fos、c-jun mRNA表达明显增强；与偏头痛模型组比较，头风颗粒预防组和头风颗粒治疗组大鼠PAG区c-fos和c-jun mRNA表达明显减弱。

注：正常对照组1，模型组5.310652，治疗组1.439488，预防组1.174643

注：正常组1，模型组5.798001，治疗组1.665038，预防组1.262835

2.4 各组大鼠PAG区c-fos和 c-jun阳性细胞数比较

镜下观察脑膜毛细血管、炎性细胞渗出现象及组织细胞形态(图1、图2、图3、图4)。正常对照组：毛细血管正常，脑膜组织结构紧密。模型组：毛细血管扩张，组织水肿，细胞间结构疏松，大量炎性细胞渗出。头风颗粒治疗组：脑膜血管扩张不明显，细胞间结构较疏松，有少量炎性细胞渗出。头风颗粒预防组：毛细血管扩张不明显，部分血管周围有少量炎性细胞渗出。

组别动物(只)c-fos(个)c-jun(个)正常对照组 1211.96±0.9213.32±0.61偏头痛模型组 1282.96±2.08∗88.53±1.25∗头风颗粒预防组1223.44±1.59△27.81±1.46△头风颗粒治疗组1222.90±1.15△24.58±0.74△

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与偏头痛模型组比较，△P<0.01。

2.5 各组大鼠PAG区 c-fos和c-jun阳性细胞灰度比较

与正常对照组比较，偏头痛模型组c-fos和c-jun阳性细胞灰度减弱，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；与偏头痛模型组比较，头风颗粒治疗组和预防组c-fos和 c-jun阳性细胞灰度明显增强，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表2。

组别动物(只)c-fosc-jun正常对照组 12241.06±1.91237.79±2.91偏头痛模型组 12193.26±1.48∗181.61±1.64∗头风颗粒预防组12222.63±2.71△216.68±2.27△头风颗粒治疗组12227.79±2.17△219.89±1.86△

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与偏头痛模型组比较，△P<0.01。

3 讨论

1.2.6 镜检和图像分析 光镜下，阳性细胞细胞核染色体呈现棕黄色，多为圆形或者卵圆形。在200倍光镜下全面观察切片，随机选取各组大鼠脑部切片上端和下端不重复的6个视野，对阳性细胞进行计数，利用Leica DM480图像分析软件分析每张切片上每个视野的平均灰度。

中脑导水管周围灰质(PAG)是位于中脑顶盖与被盖之间，环绕中脑导水管周围的一片区域，其头侧起自后联合水平，尾侧达蓝斑核首侧水平[6]。PAG具有极其复杂功能，是中枢神经系统中较重要结构，它参与痛觉调控，还与恐惧、焦虑、自主神经功能、睡眠等的调控活动密切相关[7]。作为重要的痛觉调整中枢[8]，中脑导水管周围灰质既可接收来自脊髓和延髓的伤害性刺激，将疼痛信息向上传递至更高级中枢，又可抑制过度疼痛信息的下行传递[9]。

一般将PAG分为四个区：内侧区、腹外侧区、背外侧区和背侧区。PAG腹外侧区在深部结构的伤害性疼痛信息处理中起重要作用，Tassorelli等[10]发现刺激中脑导水管腹外侧区可出现情绪低落、心动过缓、低血压等自主神经功能紊乱症状，而以上这些自主神经紊乱症状在偏头痛发作时也伴随出现；Raskin[11]研究中发现，在一组非偏头痛患者PAG区植入刺激电极后出现偏头痛样头痛发作，最早提出PAG为人类偏头痛疼痛的中枢来源。另外，组织形态学[12]、影像学研究[13-14]等也有相关PAG与疼痛关系研究，均提示PAG在偏头痛发病中具有重要作用。

即早基因c-fos、c-jun与痛觉调控关系密切，诸多研究表明，疼痛、创伤等伤害性刺激可诱发中枢神经系统(CNS)内即早基因家族c-fos、c-jun的表达，实验研究中，偏头痛模型中枢神经系统c-fos常被作为神经元激活的标记物。在即早基因与偏头痛的关系研究中，Moskowitz[15]研究发现，偏头痛发作可刺激三叉神经核尾核细胞内即早基因c-fos、c-jun大量表达，当服用治疗药物舒马曲坦后，其表达受到了抑制；Cristina等[16]研究发现，偏头痛发作时，下丘脑、脑干等处c-fos基因表达明显增强，刘斌等[17]研究发现，偏头痛模型大鼠中脑导水管周围灰质、下丘脑 c-fos、c-jun基因表达增强。任永新等[18]研究证实偏头痛大鼠模型脑干、下丘脑c-fos、c-jun基因表达增强，中药头风饮能显著抑制基因高表达。

本项目实验研究结果显示：硝酸甘油型偏头痛动物模型造模成功，造模后大鼠出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多等症状行为学变化；镜下观察大鼠脑膜血管扩张，神经性炎症形成；RT-PCR方法检测发现，中脑导水管周围灰质c-fos和 c-jun mRNA表达增强，中药头风颗粒预防给药和治疗给药均能抑制其基因表达。与正常对照组相比，偏头痛模型组c-fos和c-jun mRNA表达明显增强、c-fos和c-jun阳性细胞数明显增多；与偏头痛模型组比较，头风颗粒治疗组和头风颗粒预防组c-fos和c-jun mRNA表达明显减弱，c-fos和c-jun阳性细胞数减少，有显著统计学差异，P<0.01，说明头风颗粒可以下调PAG区c-fos和 c-jun基因表达，从而抑制痛觉信息的传递，从而发挥治疗和预防偏头痛的作用。

3.1 通过综合实践对单项课程的知识与技能进行融合 通过综合实践课程建设将原本被课程割裂的知识与技能进行深度融合，帮助学生整合现有的知识结构，以解决实际问题，让学生能够与具体工作领域的任务相对接。

综上所述，头风颗粒可以明显减轻硝酸甘油引起的神经性炎症，显著抑制偏头痛大鼠中脑导水管周围灰质c-fos、c-jun基因表达，改善偏头痛模型大鼠症状行为学变化，从分子机制上阐明了头风颗粒预防和治疗偏头痛的作用机理。