金银花绿原酸与芦丁、槲皮素协同抗氧化作用

石艳宾*，鲍佳彤，王亦萱，李文静

1. 天津天狮学院（天津 301700）；2. 天津嘉汇捷瑞医药科技有限公司（天津 301800）

金银花为忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾，主要功效成分有绿原酸、黄酮、挥发性油、木樨草苷等[1-2]。金银花在中国具备悠长的保健历史与药用历史，是药食两用植物，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌消炎、降血压、延缓衰老、保肝利胆、兴奋中枢神经系统、提高免疫力等药理作用[3]。Sato等[4]、李文娜等[5]指出杜仲叶绿原酸类物质具有较高的抗氧化活性，能有效清除二苯代苦味酰肼自由基（DPPH）、超氧阴离子自由基、羟自由基（·OH）、烷基自由基，对缺血再灌注损伤细胞具有明显的保护作用。槲皮素、芦丁是典型黄酮类物质，能有效清除脂质自由基、·OH、超氧阴离子自由基等，具备提高免疫力、抗衰老、降血糖血脂、抗心律失常、抗癌、杀菌等生理活性[6-7]。摆玉芬等[8]、周伟婧等[9]分析了番茄红素与葡萄籽油、VE、原花青素及荔枝皮原花青素与VC、VE间协同抗氧化研究，研究表明在增加浓度的条件下复合抗氧化剂比单一组分的总活性的抗氧化能力强，主要是由于抗氧化成分之间常具备抗氧化协同的特征。黄酮与多酚类物质、黄酮类化合物间具有协同抗氧化性[10-11]，以DPPH自由基清除能力为抗氧化能力的衡量指标，分析槲皮素、芦丁对金银花绿原酸提取物的抗氧化增效作用，为酚类物质与黄酮类物质复配抗氧化剂开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿原酸、芦丁、槲皮素（纯度≥98%，中国药品生物制品检定研究院）；DPPH：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；VC、无水乙醇、甲醇（分析纯，天津市汇杭化工科技有限公司）；金银花（湖北明腾生物科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

UV1000紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；KQ-200VDV超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；TD5K-Ⅲ低速离心机（长沙东旺实验仪器有限公司）；ME204E分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；PL403电子天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金银花中绿原酸的提取工艺

1) 金银花绿原酸的提取。称取20 g金银花粉末于锥形瓶中，按料液比1∶20（g/mL）加入70%乙醇溶液，在超声功率200 W、温度60 ℃下超声提取25 min。将绿原酸超声提取液冷却至室温后，在5 000 r/min下离心20 min，取其上清液于棕色试剂瓶中，冷藏备用。

2) 绿原酸含量的测定。配制质量浓度为120 μg/mL绿原酸标准溶液，分别移取0，1，2，3，4，5和6 mL于25 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，制成绿原酸标准待测溶液。以零管为空白参照，在波长328 nm处测定系列标准溶液吸光度。以绿原酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线，得到线性回归方程和相关系数R2值，并以此为依据计算金银花绿原酸提取液的浓度。

1.3.2 清除DPPH自由基能力的测定

将按照1.3.1小节提取得到的金银花绿原酸提取溶液、槲皮素溶液和芦丁溶液，配制成一系列适宜浓度梯度的样品溶液。取0.3 mL待测样品溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液，混合混匀，静置反应30 min后，在515 nm处测定系列样品溶液的吸光度，作为系列样品溶液反应后Ar；在0.3 mL待测样品溶液、0.6 mL 70%乙醇溶液反应后，测定样品底液Ax；在0.3 mL乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol/L DPPH溶液反应后，得到空白对照Ac[12]。根据式（1）计算金银花绿原酸提取溶液、槲皮素溶液、芦丁溶液的DPPH自由基清除率SR值。依据金银花绿原酸、槲皮素、芦丁系列浓度样品溶液SR，绘制样品溶液浓度-DPPH自由基清除率曲线，计算半数清除率IC50值。

1.3.3 绿原酸与芦丁、槲皮素复配SR值的测定

将金银花绿原酸提取液分别与芦丁、槲皮素按体积比1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1的比例复配，按照1.3.2小节测定复配后混合液DPPH自由基清除率，计算复配溶液的试验半数清除率IC50mix。依据式（2）计算复配溶液理论半数清除率IC50add，分析芦丁、槲皮素对金银花绿原酸提取溶液的抗氧化增效作用。采用t检验法比较分析复配溶液的IC50add和IC50mix，确定是否有显著性差异。若复配溶液试验半数清除率IC50mix＜理论清除率IC50add值，表示两者间有协同作用[9,13]。

式中：P1为金银花绿原酸在复配组中占的比例；P2为芦丁或槲皮素在复配组中占的比例，P2=1-P1；R为绿原酸与芦丁或槲皮素单独作用时的效价比，即R=IC50A/IC50B。

1.3.4 绿原酸、芦丁、槲皮素之间清除DPPH自由基能力的测定

参考金银花绿原酸、芦丁、槲皮素DPPH自由基清除能力，制备质量浓度为25 μg/mL三种样品溶液。将金银花绿原酸、芦丁、槲皮素三者按体积比1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3比例混合均匀，依据1.3.2小节测定三者复配混合液的DPPH自由基清除率，应用抗氧化协同系数SE值（复合溶液测定的清除率（ESC）和理论清除率（TSC）之间的比值）分析三者间的协同抗氧化作用。根据式（3）计算复配溶液TSC值，计算不同复配组合下的抗氧化协同系数SE。

式中：ESC1、ESC2、ESC3分别为复合溶液中绿原酸、芦丁、槲皮素的试验清除率。

若抗氧化协同系数SE＜1，则表示绿原酸提取物与芦丁、槲皮素间没有明显的协同作用；若SE＞1，则表示绿原酸提取物与芦丁、槲皮素间具有协同作用。

2 结果与分析

2.1 金银花绿原酸提取液制备

以绿原酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出绿原酸标准曲线，详见图1。线性回归方程为y=0.049 21x-0.015 7，R2=0.999 0。依据1.3.1小节测定金银花绿原酸提取液中绿原酸的浓度，为2.319 2 mg/mL。

图1 绿原酸标准曲线图

2.2 金银花绿原酸清除DPPH自由基能力分析

依据1.3.2小节，将金银花绿原酸提取液、芦丁、槲皮素配制质量浓度依次为5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL的样品溶液，计算出金银花绿原酸提取液、芦丁、槲皮素、VC系列样品溶液SR值、回归方程、IC50值、R2值，详见图2、表1和表2。由图2可知，4种样品溶液对DPPH自由基均有较强的清除作用，且其清除能力随着样品浓度的增大而增强，但达到一定浓度后，清除DPPH自由基的能力增长缓慢。由表1可知，金银花绿原酸对清除DPPH自由基的作用强于芦丁、VC，弱于槲皮素，说明金银花绿原酸具有较强的抗氧化能力。

2.3 绿原酸与芦丁、槲皮素协同抗氧化作用研究

2.3.1 金银花绿原酸与芦丁协同清除DPPH自由基能力分析

依据1.3.2小节，测定金银花绿原酸提取液和芦丁溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1复配时的DPPH自由基清除率，并计算复配溶液IC50add，分析金银花绿原酸与芦丁协同清除DPPH自由基能力。由图3可知，绿原酸、芦丁复配溶液的试验半数清除率IC50mix＜理论清除率IC50add，表明两者间具有协同抗氧化作用。对比表2不同复配比例金银花绿原酸、芦丁混合液的IC50值，当复配比例为9∶1时，DPPH自由基半数清除率为27.97%，协同清除DPPH自由基的效果较好。

2.3.2 金银花绿原酸与槲皮素协同清除DPPH自由基能力分析

图2 绿原酸、芦丁、槲皮素、VC清除DPPH自由基能力

表1 绿原酸、芦丁、槲皮素、VC回归方程与半数清除率

表2 绿原酸与芦丁复配溶液抗氧化性回归方程与半数清除率

图3 绿原酸与芦丁复配混合液协同抗氧化分析

依据1.3.2小节，测定金银花绿原酸提取液和槲皮素溶液按比例1∶1，1∶3，3∶1，1∶9和9∶1复配时的DPPH自由基清除率，并计算复配溶液IC50add，分析金银花绿原酸与槲皮素协同清除DPPH自由基能力。由图4可知，绿原酸、槲皮素复配溶液的试验半数清除率IC50mix＜理论清除率IC50add，表明两者间具有协同抗氧化作用。对比表3不同比例金银花绿原酸、槲皮素混合液的IC50值，当复配比例为1∶9时，DPPH自由基半数清除率为17.76%，协同清除DPPH自由基的效果较好。

图4 绿原酸与槲皮素复配溶液抗氧化能力分析

表3 金银花绿原酸与槲皮素不同复配比例回归方程与半数清除率

2.3.3 绿原酸、芦丁、槲皮素协同清除DPPH自由基能力分析

依据1.3.2小节，测定金银花绿原酸提取液、芦丁、槲皮素溶液比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3复配时的DPPH自由基清除率，分析芦丁、槲皮素对金银花绿原酸抗氧化性的协同作用。由图5可知，当金银花绿原酸、芦丁、槲皮素复配比例为1∶3∶3时，SE值为1.20，三者间协同清除DPPH自由基的效果较好。

图5 槲皮素、芦丁、绿原酸混合液抗氧化能力分析

3 结论

采用超声波辅助提取金银花中的绿原酸，分析芦丁、槲皮素对金银花绿原酸抗氧化增效作用。金银花绿原酸、芦丁、槲皮素清除DPPH自由基能力随着抗氧化物质浓度的增加而增大，其IC50值分别为33.80%，45.38%和26.77%。通过对比3种抗氧化剂的IC50值可知，对DPPH自由基的清除能力大小依次为：金银花绿原酸抗氧化效果强于芦丁，弱于槲皮素。将金银花绿原酸分别于芦丁、槲皮素按不同比例进行复配，结果发现芦丁、槲皮素对绿原酸的抗氧化能力具有协同增效作用。当绿原酸与芦丁复配比例为9∶1时，复配混合液的IC50值为27.97%；当绿原酸与槲皮素复配比例为1∶9时，复配混合液的IC50值为25.99%，清除DPPH自由基的能力最强。将金银花绿原酸、芦丁、槲皮素按固定比例1∶1∶1，1∶3∶1，1∶1∶3，3∶1∶1，1∶3∶3，3∶3∶1和3∶1∶3进行复配，当复配比例为3∶3∶1时，清除率最高为77.57%，且SE值为1.20，表明槲皮素、芦丁对金银花绿原酸具有较好的抗氧化协同增效作用。