淫羊藿女贞子配伍(4∶3)影响自然衰老大鼠脾脏及胸腺的研究

马紫童 王雪帆 唐秀凤 高莹莹 王 瀚 刘仁慧

随着社会的发展、医学的进步，人类平均寿命不断增高，人口老龄化已成为全世界面临的一个严重的社会问题[1]。延缓衰老以减轻衰老引发的慢性疾病在人口日益老龄化的中国尤其具有重要意义。有研究证实，自然衰老大鼠出现免疫器官胸腺及脾脏的增龄性退化，且与氧化损伤的累积有一定关系[2]。淫羊藿、女贞子是临床常用的延缓衰老的补肾中药，二者配伍具有平调肾中阴阳之功，是国家级名老中医李世增教授积50余年的临床经验所总结的，常用于治疗衰老相关疾病的药对。前期实验研究表明，淫羊藿和女贞子配伍对于慢性衰老相关疾病骨质疏松以及慢性肺部疾病哮喘均有显著疗效[3,4]。文献报道，淫羊藿、女贞子均有良好的免疫调节及抗氧化作用，但对于衰老过程中免疫器官的退化及氧化损伤的作用尚未有研究[5,6]。本研究基于上述认识，选择自然衰老大鼠模型，通过检测胸腺及脾脏退行性的病理改变及脾脏自由基水平的改变，结合神经网络模型进行综合评价，探讨中药淫羊藿和女贞子单用及配伍对免疫器官衰老的影响作用的差异[7]。

材料与方法

1.实验动物：SPF级3月龄(8只)、6月龄组(8只)、8月龄(56只)健康雄性SD大鼠，由北京维通利华实验动物技术股份有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(京)2016-0006，动物伦理学号：AEEI-2016-178。

2.试剂：总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)检测试剂盒 (货号：A015-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)测定试剂盒(货号：A013-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒 (货号：A003-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒 (货号：A001-3)均购于南京建成生物工程研究所。

3.实验仪器：电动匀浆机(上海精密仪器仪表有限公司)；SpectraMax Plus 385全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)；全自动生化仪(日本奥林巴斯株式会社，型号：AU480)；尼康(日本Nikon公司)ECLIPSE 80i 生物显微镜及NIS-Elements BR 3.2 图像分析软件(北京锐驰恒业仪器科技有限公司)。

4.药材及煎煮方法：中药饮片炙淫羊藿(批号：23820701，产地：陕西)及酒女贞子(批号：170517003，产地：甘肃)购于北京同仁堂药店，由北京美康唐医药科技有限公司炮制加工。分别称取适量的淫羊藿饮片、女贞子饮片、淫羊藿女贞子饮片配伍(4∶3)制备淫羊藿煎剂、女贞子煎剂及淫羊藿女贞子煎剂。首煎加8倍体积的水浸泡1h后加热煮沸，文火保持沸腾30min，搅拌，趁热滤取药液；药渣再加原药量6倍的水加热煮沸，改文火续煎30min后过滤，合并两次药液，浓缩后4℃保存。

5.分组及给药:8月龄大鼠随机分为7组，包括9月龄组、12月龄组、15月龄组、17月龄组、淫羊藿女贞子组(配伍组)、淫羊藿组、女贞子组，每组8只。SPF级3月龄(8只)、6月龄(8只)作为青年对照组。17月龄组、淫羊藿组、女贞子组、配伍组正常饲养至15月龄后分别给予等体积的蒸馏水、淫羊藿煎剂0.20g/ml、女贞子煎剂0.15g/ml、淫羊藿女贞子煎剂0.35g/ml体重(相当于临床等效剂量)灌胃，连续2个月。

6.处死及取材：3、6月龄组大鼠购买后适应环境1周后处死；9、12、15、17月龄组饲养至相应月龄后处死；各给药组饲养至17月龄后处死。禁食16h后，称重。腹腔注射乌拉坦麻醉后，剖取脾脏、胸腺。称重后，切除一部分放入10%甲醛固定；其余迅速放入液氮，后转入-80℃冰箱保存。

7.检测方法：脏器指数=脏器重量(g)/体质量(g)。每组取7只样本，行组织HE染色切片，每张切片在200倍镜下选取3个不同的视野进行测量病理学参数，计算平均值。脾组织病理学参数：参考文献[8]测量脾小体直径。胸腺的病理学参数：参考文献[9]测量皮质/总面积、髓质/总面积。制备脾脏匀浆，采用考马斯亮蓝法测定匀浆上清中蛋白含量；微板法测定匀浆中NO测水平；比色法测定T-AOC水平；WST-1法测定SOD测水平；TBA法测定MDA水平。以上检测均按照测试盒说明书进行。

结 果

1.大鼠脾脏指数及病理的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响：与3月龄组比较，12、15、17月龄组脾脏重量显著升高(P均<0.01)，9、12、15、17月龄组脾脏指数显著降低(P均<0.01)，各组脾小体直径显著降低(P<0.05或0.01)。与6月龄组比较，15、17月龄组脾脏指数及脾小体直径显著降低(P均<0.01)。与17月龄衰老大鼠比较，淫羊藿组、女贞子组和配伍组脾小体直径均显著增加(P均<0.01，表1,表2，图1)。

表1 不同月龄组大鼠脾脏指数及脾小体直径的比较

与3月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01；与6月龄组比较，△P<0.01；与9月龄组比较，#P<0.01；与12月龄组比较，▲P<0.05；脾脏重量及指数：n=8；脾小体直径：n=7

表2 淫羊藿女贞子对衰老大鼠脾脏指数及脾小体直径的影响

与17月龄组比较，*P<0.01。脾脏重量及指数：n=8；脾小体直径：n=7

2.大鼠脾脏T-AOC、SOD、MDA及NO的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响：不同年龄组大鼠脾脏T-AOC、SOD、NO水平在6月龄组达到峰值，之后随着月龄的增加而逐渐降低；而脾脏MDA水平在6月龄最低，之后随着月龄的增加而逐渐升高(P均<0.01)。与17月龄老年大鼠比较，各用药组大鼠脾脏SOD水平均显著升高(P均<0.01)；且配伍组的作用优于淫羊藿单用组(P<0.05，表3，表4)。

图1 各组大鼠脾脏病理HE染色照片(×200)A.3月龄组；B.6月龄组；C.9月龄组；D.12月龄组；E.15月龄组；F.17月龄组；G.淫羊藿组；H.女贞子组；I.配伍组

表3 不同月龄组大鼠脾脏T-AOC、SOD、MDA及NO的比较

与3月龄组比较，*P<0.01；与6月龄组比较，△P<0.01；与9月龄组比较，#P<0.01；与12月龄组比较，○P<0.01；与15月龄组比较，▲P<0.01

表4 淫羊藿女贞子对衰老大鼠脾脏T-AOC、SOD、MDA及NO的影响

与17月龄组比较，*P<0.01；与配伍组比较，#P<0.05

3.大鼠胸腺指数及病理的增龄性改变及淫羊藿和女贞子的影响：与3月龄组比较，其余各月龄组胸腺指数均显著降低(P<0.01)，除15月龄组外各组胸腺重量显著降低(P<0.05)；12、15、17月龄组胸腺病理参数，包括皮质、髓质与面积比值，与3、6、9月龄组比较，差异均有统计学意义(P均<0.01)；17月龄组胸腺病理参数与12月龄组比较，差异有统计学意义(P均<0.05)，与17月龄组衰老大鼠比较，淫羊藿和配伍组能显著升高胸腺指数(P<0.01)，但仅配伍组对胸腺的病理参数有显著改善作用(P均<0.05，表5，表6，图2)。

表5 不同月龄组大鼠胸腺指数及病理参数的比较

与3月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01；与6月龄组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与9月龄组比较，#P<0.01；与12月龄组比较，○P<0.05；胸腺重量及指数：n=8；胸腺病理参数(皮质/总面积、髓质/总面积)：n=7

表6 淫羊藿女贞子对衰老大鼠胸腺指数及病理参数的影响

与17月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01。胸腺重及胸腺脏指数：n=8；胸腺病理参数(皮质/总面积、髓质/总面积)：n=7

图2 各组大鼠胸腺病理HE染色照片(×200)A.3月龄组；B.6月龄组；C.9月龄组；D.12月龄组；E.15月龄组；F.17月龄组；G.淫羊藿组；H.女贞子组；I.配伍组

4.基于神经网络模型评价淫羊藿女贞子对衰老大鼠脾脏和胸腺的综合作用：对6个不同月龄组的12项检测指标应用多层感知(multi-layer perceptron，MLP)神经网络分析，其中训练样本39，测试样本9个，得到的模型训练样本相对错误预测5%，测试样本相对错误预测5.7%。利用此模型对给药各组样本的12项数据进行年龄预测，得到配伍组预测年龄为14.25±0.54个月，与17月龄组的预测值16.39±0.21个月比较有显著降低(P<0.01)；与淫羊藿组、女贞子单用组比较，差异无统计学意义。根据输入指标对网络的影响程度，可知胸腺指数、脾脏SOD、脾小体直径、脾脏指数、脾脏T-AOC是本神经网络模型中更为重要的影响因素(表9，图3)。

表9 基于神经网络模型对给药各组的年龄预测

与17月龄组比较，*P<0.05,**P<0.01

图3 MLP输入变量重要性分析

讨 论

祖国医学则认为五脏皆虚是衰老之本，认为脏腑虚衰是导致人体衰老、死亡的原因，与现代医学衰老过程中人体器官组织的增龄性退行性损变相符[10]。在中医学对于衰老的认识的诸多学说中，肾虚衰老学说一直占主导地位。中医认为肾为先天之本，主藏精；肾精通过肾阳蒸化肾阴产生肾气，而肾气则直接关系到人体的生长、发育、生殖和衰老[11]。故肾中精气不足，肾虚渐亏是衰老的核心及根本原因，且始终贯穿于整个衰老过程[12]。基于上述肾虚与衰老的联系，中医药抗衰老的治疗历来强调补肾方药的应用。淫羊藿、女贞子作为常用的延缓衰老的补肾中药，淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，研究表明其具有延缓衰老的作用，与抗氧化、降脂、调节免疫、改善学习记忆能力，提高心血管功能及生殖功能等有关[5，13]。女贞子具有滋补肝肾、明目乌发的功效，研究表明其具有的延缓衰老的作用，与抗氧化、护肝、抗炎、降脂、调节免疫、抗骨质疏松等药理作用有关[14,15]。淫羊藿女贞子配伍可平补肾中阴阳，是国家级名老中医李世增教授常用于治疗衰老相关疾病的基本药对组合。李世增教授临床上遵张景岳“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”的配伍指导，在补肾药中筛选淫羊藿、女贞子二药配伍“平补阴阳、补肾益精”，随症加减组方，用于肾阴虚、肾阳虚及肾精不足、阴阳两虚等证取得较好的疗效。

免疫衰老是免疫系统全方位多系统的并由基因严格控制的循序渐进的自然过程，表现为随着年龄的増加免疫系统进行性损伤，对感染的控制能力降低，且免疫衰老的始因在于增龄导致胸腺的萎缩[16]。本研究证实，3月龄青年大鼠胸腺指数及胸腺皮质占比最高，之后随着老年大鼠月龄的增加，胸腺重量及指数均显著降低，胸腺萎缩，胸腺皮质占比显著降低，胸腺皮质厚度逐渐变薄，说明不成熟前体T细胞随年龄增长逐渐减少，与报道结果相符[2]。笔者同时观察到自然衰老大鼠脾组织也出现退行性的病理改变，脾脏中脾小体的直径随年龄增加而降低，提示脾脏免疫功能降低；同时脾组织中SOD、T-AOC及NO水平显著降低，且MDA水平显著升高，提示脾脏中自由基水平随年龄增大而增加，抗氧化能力降低，脾脏退行性的病理改变与自由基损伤有关，与文献报道一致[2]。基于中药淫羊藿、女贞子单用及配伍使用后，均能增加衰老大鼠脾小体直径，升高脾脏SOD水平；淫羊藿及配伍组增加胸腺指数，仅配伍组可显著改善胸腺的病理参数，提示二药配伍有对免疫器官胸腺及脾脏的退行性的病理改变具有较好的改善作用。

综上所述，基于神经网络模型综合评价了淫羊藿、女贞子单用及配伍的作用，证实淫羊藿、女贞子单用及配伍对衰老大鼠胸腺及脾脏均有显著改善作用(P<0.05)，但单用及配伍组之间比较，差异无统计学意义。因淫羊藿、女贞子对脾脏T-AOC无显著改善作用，提示二药影响脾脏的退行性改变的作用可能与抗氧化作用关系并不密切，可能通过其他的途径，尚有待于进一步研究。