负压创面疗法对Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血内皮祖细胞循环数量的影响研究

孟素玉 赵鹏

[摘要]目的：探討负压创面疗法（Negative pressure wound therapy，NPWT）对于Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）循环数量的影响。方法：本研究纳入了2017年3月-2019年3月在笔者医院烧伤科接受治疗的Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者130例，将患者随机分为观察组（n=65）和对照组（n=65），均接受常规治疗，观察组在此基础上接受NPWT治疗，疗程为1周，比较两组患者治疗前后的外周血EPCs数量，并分析影响其变化的因素。结果：治疗后，观察组的外周血EPCs数量明显增加[（85.3±18.1）×106 vs（34.1±12.5）×106]，差异有统计学意义（P<0.05）。而对照组无明显变化[（45.2±19.4）×106 vs（34.7±16.8）×106]，差异无统计学意义（P>0.05）。此外，观察组的治疗后外周血的血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和肉芽组织内的VEGF和基质细胞衍生因子-1α（Stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）均显著增加（P<0.05），而对照组没有明显变化（P>0.05）。相关性分析结果显示，外周血EPCs数量与外周血和肉芽组织内的VEGF和SDF-1α水平显著相关（P<0.05）。结论：NPWT可以增加Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血EPCs数量，其机制可能与全身性和局部性的VEGF和SDF-1α水平上调相关。

[关键词]负压创面疗法;Ⅲ/Ⅳ度烧伤;内皮祖细胞;血管内皮生长因子;基质细胞衍生因子;肉芽组织

[中图分类号]R644    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）05-0082-04

Abstract： Objective  The present study was designed to investigate the effect of negative pressure wound therapy （NPWT） on the number of endothelial progenitor cells （EPCs） in patients with Ⅲ/Ⅳ burns. Methods  A total of 130 patients with grade Ⅲ/Ⅳ burns who were treated in the burn department of our hospital from March 2017 to March 2019 were enrolled. The patients were randomly divided into the observation group （n=65） and the control group （n= 65）. All patients received the routine treatment. In addition， the patients in the observation group received NPWT treatment in addition to the routine treatment. The course of treatment was one week. The number of peripheral blood EPCs before and after treatment in the two groups were compared， and the factors affecting the changes were analyzed. Results  After treatment， the number of EPCs in the peripheral blood of the observation group were increased significantly [（85.3±18.1）×106 vs （34.1±12.5）×106]， the difference was statistically significant（P<0.05）. While the control group had no significant change [（45.2±19.4）×106 vs （34.7±16.8）×106， P>0.05]. In addition， the levels of vascular endothelial growth factor （VEGF） in peripheral blood and VEGF and stromal cell-derived factor-1α （SDF-1α） in granulation tissue were significantly increased in the observation group（P<0.05）， while the control group did not have significant change（P>0.05）. Correlation analysis showed that the number of peripheral blood EPCs was significantly correlated with VEGF and SDF-1α levels in peripheral blood and granulation tissue （P<0.05）. Conclusion  NPWT can increase the number of EPCs in peripheral blood of patients with Ⅲ/Ⅳ burns. The mechanism may be related to the up-regulation of systemic and local VEGF and SDF-1α levels.

Key words： negative pressure wound therapy（NPWT）; Ⅲ/Ⅳ degree burn; endothelial progenitor cells; vascular endothelial growth factor; stromal cell-derived factor; granulation tissue

对于烧伤创面来说，充分的外科清创，有效的抗生素治疗，纠正代谢异常，适当的伤口处理对于愈合至关重要[1-2]。但是，尽管经过了全面治疗，Ⅲ/Ⅳ度烧伤创面经常无法完全愈合。近年来，临床上开始采用负压创面疗法（Negative-pressure wound therapy，NPWT）来治疗Ⅲ/Ⅳ度烧伤创面[3-4]。NPWT是指用含有引流管的VSD敷料来覆盖或填充皮肤软组织创面，用半生物膜进行封闭，形成一个密闭空间，最后经引流管连接负压源，通过可控制的负压来促进创面愈合的一种全新治疗方法[5-6]。研究发现，NPWT可以通过改善伤口的血供来促进创面愈合，其机制可能与其可以促进创面的新生血管形成有关[3，7]。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是前体血管内皮细胞，通过生理或病理因素的刺激，从骨髓转移到外周血，最终到达缺血部位，修复受损血管[8-9]。近年来的研究发现，糖尿病下肢缺血性溃疡患者在经过1～2个疗程的NPWT治疗后，外周血EPCs数量明显增加，提示外周血EPCs数量可能与创面愈合有相关性。本研究旨在探讨NPWT对于Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血EPCs循环数量的影响，及其作用机制。

1  资料和方法

1.1 临床资料：本研究纳入了2017年3月-2019年3月在笔者医院烧伤科接受治疗的Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者130例。纳入标准：①年龄≥18岁;②Ⅲ/Ⅳ度烧伤，时间≥4周;③创面面积2～20cm2;④无严重心、肺、肝、肾功能不全。排除标准：①既往6个月内接受过糖皮质激素、免疫抑制剂、雌激素或外源性细胞因子，包括表皮生长因子、促红细胞生成素或重组人粒细胞集落刺激因子等治疗;②既往4周内服用过他汀类药物;③既往接受过NPWT治疗。将患者随机分为观察组（n=65）和对照组（n=65）。观察组：男/女为37/28;年龄（47.53±9.30）岁;烧伤原因：热液32例，火焰18例，其他15例;烧伤程度：Ⅲ度烧伤35例，Ⅳ度30例;住院时间（12.41±3.06）d。对照组：男/女为32/33;年龄（46.85±11.42）岁;烧伤原因：热液30例，火焰23例，其他12例;烧伤程度：Ⅲ度烧伤33例，Ⅳ度32例;住院时间（13.08±2.93）d。两组患者的年龄、性别比例、烧伤原因、烧伤严重程度及住院时间比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法：两组患者均接受了常规创面清创，抗生素治疗，纠正代谢异常等治疗，具体包括：均用l：1 000的新洁尔灭清洗消毒创面，清除严重污染、皱缩及游离坏死的疱皮。在水疱的最低位剪破疱皮引流，注意保留疱皮的完整性，以减少体液蒸发和感染几率。用无菌敷料将创面拭干。对照组：根据创面大小，将磺胺嘧啶锌软膏涂抹在无菌敷料上贴敷创面，厚度为2～3cm，再予无菌敷料包扎。

观察组：在常规创面清创后，清洁创面周围皮肤，将VSD引流管连到负压装置（施乐辉公司，英国），确保VSD医用敷料与需要引流的全部创面得到充分接触不留空隙，引流管由创面边缘引出，用生物半透性薄膜封闭粘贴所有创面，完全覆盖周围健康皮肤2～3cm，24h持续吸引，負压一般调整在-16.67kPa较适合。若引流管较多可用“Y”形接头，或三通接头并联后再接负压装置，将生理盐水500ml+庆大霉素8×104～16×104U使用输液器与VSD的冲洗管相连，冲洗液持续匀速滴入，8～10滴/min，500～1 000ml/d。如果创伤面积大，患者可使用多个VSD，在每个VSD接头上接一组冲洗液，或每隔2h更换1次冲洗接头，以确保创面的各个部位得到彻底冲洗，避免创面坏死组织脱落导致管道堵塞，降低冲洗效果。

1.3 评估指标：在治疗前和治疗后24h内采集肘正中静脉血，使用无菌解剖剪和镊子采集创面肉芽组织样品，大小约1cm×1cm，采用FACSCalibur流式细胞仪（BD公司，美国）测量EPCs数量，CD34+、CD133+以及KDR+细胞代表EPCs的数量。

1.4 ELISA法检测血清VEGF和SDF-1α水平：酶标仪采用HBS-1096C Pro自动酶标仪（上海珂淮仪器有限公司），VEGF和SDF-1α的ELISA检测试剂盒分别为北京普尔伟业生物科技有限公司上海森雄科技实业有限公司生产。根据试剂盒说明书严格操作，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清VEGF和SDF-1α水平。

1.5 Western blot法检测肉芽组织中VEGF和SDF-1α蛋白质表达水平：将肉芽组织样品在含有PMSF和0.02%蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中匀浆，将匀浆4℃，12000×g离心10min收集上清液。进行蛋白定量，取50μg蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转至硝酸纤维膜上，并在4℃下与抗VEGF一抗（1：1 000），抗SDF-1α一抗（1：2 000）和抗GAPDH一抗（1：5 000）孵育。4℃冰箱过夜孵育后洗涤加入二抗，室温孵育2h，Washing-buffer洗涤后显色液显色，以GADPH作为内参检测细胞中相关蛋白的表达，每组实验重复3次。

1.6 统计学分析：采用IBM SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以百分比（%）表示。计量资料采用组间t检验分析。计数资料采用χ2或Fisher检验。采用Pearson相关性分析与多元线性逐步回归分析研究影响治疗后EPCs数量变化的相关因素。P<0.05则认为差异有统计学意义。

2  結果

2.1 两组患者治疗前后外周血EPCs、VEGF和SDF-1α水平比较：两组患者治疗前外周血EPCs、VEGF和SDF-1α水平比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。与治疗前相比较，观察组治疗后的外周血EPCs、VEGF和SDF-1α水平明显增加，且观察组治疗后外周血EPCs、VEGF和SDF-1α水平明显高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.05）。见表1。

2.2 两组患者治疗前后肉芽组织VEGF和SDF-1α水平比较：两组患者治疗前肉芽组织VEGF和SDF-1α水平比较，差异无统计学意义（均P>0.05）。与治疗前比较，观察组治疗后肉芽组织VEGF和SDF-1α水平明显增加，且观察组治疗后的肉芽组织VEGF和SDF-1α水平明显高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.05）。见图1。

2.3 两组患者治疗前后EPCs变化与VEGF和SDF-1α水平变化的相关性分析：观察组治疗前后的EPCs变化与VEGF和SDF-1α水平变化显著正相关（均P<0.05），对照组治疗前后的EPCs变化与VEGF和SDF-1α水平变化无明显相关性（均P>0.05）。见表2。

3  讨论

NPWT作为一种新型引流技术已得到外科界广泛应用。该技术使整个与敷料相接触的创面处于一个全表面封闭负压引流状态，持续将创面、腔隙内的渗液、液化坏死组织排出体外，隔绝创面与外环境。

目前，很少有研究探讨过NPWT对于烧伤患者外周血EPCs数量的影响。Seo等[10]的研究结果显示，NPWT可以动员糖尿病下肢缺血性溃疡患者的骨髓EPCs。这与本研究结果一致。本研究结果显示，NPWT可以显著增加Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者的外周血EPCs数量，明显高于对照组。但是，Seo等的研究缺乏没有接受NPWT治疗的对照组。因此无法确定外周血EPCs数量的增加是由于NPWT直接造成的。本研究主要探讨NPWT治疗对于Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者的外周血EPCs数量的直接影响。

目前对于NPWT治疗动员骨髓EPCs的具体机制尚不清楚。以往报道显示，骨髓EPCs的动员机制包括各种病理生理情况、生长因子、细胞因子以及药物等[11-13]。此外，手术和肌肉骨骼创伤也能够促进暂时性EPCs动员[14]。在所有促进EPCs动员的因素中，缺血被认为是最强烈的刺激因素之一，并且会促进合成和分泌细胞因子，例如VEGF和SDF-1α等。研究发现，VEGF和SDF-1α是促进骨髓EPCs动员的归巢到缺血性伤口的主要细胞因子[15]。Labler等[16]的研究结果显示，负压封闭技术（Vacuum-assisted closure，VAC）可以增加局部血管创伤性伤口内的VEGF水平。Wang等[17]在猪的创伤动物模型上显示，VAC可以显著增加粘附分子-1、迁移抑制因子、VEGF和胶原蛋白I的表达水平。这些研究均表明NPWT可能会通过全身性和局部性的细胞因子动员EPCs。

本研究结果显示，NPWT可以显著增加Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者的外周血和肉芽组织内的VEGF和SDF-1α表达水平，明显高于对照组。此外，观察组外周血和肉芽组织内的VEGF和SDF-1α表达水平的变化与外周血EPCs数量的变化显著正相关。上述结果表明，NPWT可能会增加Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者的外周血VEGF和SDF-1α水平，以及肉芽组织内的VEGF和SDF-1α蛋白质表达水平，从而提高骨髓EPCs的动员能力以及伤口归巢能力，从而促进创面新生血管生成和肉芽组织形成，促进创面愈合。Seo等[10]的研究结果显示，NPWT使用后外周血中VEGF水平降低，SDF-1α水平不变。这可能是由于本研究采用的是Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者，而Seo等[10]的研究采用的是2型糖尿病患者。至于为什么不同的患者人群会导致外周血中VEGF和SDF-1α水平发生不同的变化，还有待于进一步的研究。

综上所述，本研究发现NPWT可以显著增加Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血EPCs数量，其机制可能与全身性和局部性的VEGF和SDF-1α水平上调相关。

[参考文献]

[1]Vigani A，Culler CA.Systemic and local management of burn wounds[J].Vet Clin North Am Small Anim Pract，2017，47（6）：1149-1163.

[2]Sakamoto M，Morimoto N，Ogino S，et al.Preparation of partial-thickness burn wounds in rodents using a new experimental burning device[J].Ann Plast Surg，2016，76（6）：652-658.

[3]Kantak NA，Mistry R，Varon DE，et al.Negative pressure wound therapy for burns[J].Clin Plast Surg，2017，44（3）：671-677.

[4]Stanley BJ.Negative pressure wound therapy[J].Vet Clin North Am Small Anim Pract，2017，47（6）：1203-1220.

[5]Lalezari S，Lee CJ，Borovikova AA，et al.Deconstructing negative pressure wound therapy[J].Int Wound J，2017，14（4）：649-657.

[6]Mattox EA.Reducing risks associated with negative-pressure wound therapy： strategies for clinical practice[J].Crit Care Nurse，2017，37（5）：67-77.

[7]Milne J，Smith J，Chowdhury T.Negative pressure wound therapy[J].Br J Nurs，2017，26（Sup 20）：S30-S32.

[8]Peters EB.Endothelial progenitor cells for the vascularization of engineered tissues[J].Tissue Eng Part B Rev，2018，24（1）：1-24.

[9]Olivieri F，Pompilio G，Balistreri CR.Endothelial progenitor cells in ageing[J].Mech Ageing Dev，2016，159：1-3.

[10]Seo SG，Yeo JH，Kim JH，et al.Negative-pressure wound therapy induces endothelial progenitor cell mobilization in diabetic patients with foot infection or skin defects[J].Exp Mol Med，2013，45：e62.

[11]Bianconi V，Sahebkar A，Kovanen P，et al.Endothelial and cardiac progenitor cells for cardiovascular repair： A controversial paradigm in cell therapy[J].Pharmacol Ther，2018，181：156-168.

[12]Vega FM，Gautier V，Fernandez-Ponce CM，et al.The atheroma plaque secretome stimulates the mobilization of endothelial progenitor cells ex vivo[J].J Mol Cell Cardiol，2017，105：12-23.

[13]Bertagnolli M，Nuyt AM，Thébaud B，et al.Endothelial progenitor cells as prognostic markers of preterm birth-associated complications[J].Stem Cells Transl Med，2017，6（1）：7-13.

[14]Li L，Liu H，Xu C，et al.VEGF promotes endothelial progenitor cell differentiation and vascular repair through connexin 43[J].Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：237.

[15]Gao Y，Lu Z，Chen C，et al.Mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells accelerate intra-aneurysmal tissue organization after treatment with SDF-1α-coated coils[J].Neurol Res，2016，38（4）：333-341.

[16]Labler L，Mica L，H?rter L，et al.Influence of VAC-therapy on cytokines and growth factors in traumatic wounds[J].Zentralbl Chir，2006，131（S1）：S62-S67.

[17]Wang W，Pan Z，Hu X，et al.Vacuum-assisted closure increases ICAM-1， MIF， VEGF and collagen I expression in wound therapy[J].Exp Ther Med，2014，7（5）：1221-1226.

[收稿日期]2019-08-26

本文引用格式：孟素玉，趙鹏，马雅宁，等.负压创面疗法对Ⅲ/Ⅳ度烧伤患者外周血内皮祖细胞循环数量的影响研究[J].中国美容医学，2020，29（5）：82-85.