气相色谱-质谱法测定再造烟叶中甲酰胺

张建平，吴清辉，邓其馨，黄朝章，黄胜翰

(福建中烟工业有限责任公司技术中心，厦门361021)

甲酰胺是一种用途极广的化工原料和工业溶剂，具有活泼的反应性和特殊的溶解能力，可作为纸张处理剂[1-2]。但是长期吸入甲酰胺会对人的呼吸系统、神经系统、血管系统、肝脏系统等造成伤害，甲酰胺被欧盟化学品管理局列为生殖毒性物质，被国际癌症研究中心列为1B 类致癌物质[3-5]。再造烟叶在采用造纸法生产的工艺过程中可能引入甲酰胺污染，因此有必要对再造烟叶进行甲酰胺测定，以保证产品质量安全[6-7]。文献已报道的测定甲酰胺的方法均为气相色谱法，检测器主要采用氢火焰离子化检测器(FID)或氮磷检测器(NPD)。这两类方法虽然操作简单，但选择性不强，容易出现假阳性结果[8-12]。气相色谱-质谱法(GC-MS)通过采集离子碎片进行测定，定性的准确性高，是当前研究甲酰胺测定的热点[13-15]，但所涉及的对象多为泡沫、塑料、玩具等，再造烟叶中甲酰胺的测定鲜有报道。

本工作采用甲醇涡旋振荡提取的方法，建立了测定再造烟叶中甲酰胺的气相色谱-质谱法，旨在为有效监控再造烟叶中的甲酰胺提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent GC6890/MSD5973 型 气 相 色 谱-质 谱联用仪；Labnet VX-200 型涡旋混合仪；Sartorius Sigma 1-14 型高速离心机；Millipore Milli-Q 型超纯水仪；有机相滤膜(0.45μm)。

甲酰胺标准储备溶液:1 000 mg·L－1，称取100.0 mg的甲酰胺标准品，用甲醇溶解并定容于100 m L的容量瓶中。

甲酰胺标准品的纯度大于99.5%(避光保存于0～4 ℃下)；甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇和二氯甲烷均为色谱纯；试验用水符合GB/T 6682－2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的规定。

1.2 仪器工作条件

1) 色谱条件 DB-Wax 毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m，0.25μm)；进样口温度230℃；载气为氦气，载气流量2 m L·min－1；分流进样，分流比10∶1；进样量1μL。升温程序:初始温度80℃，保持2 min；以15 ℃·min－1速率升温至210 ℃，保持2 min。

2)质谱条件 电子轰击离子源(EI)；溶剂延迟3 min；接口温度230 ℃；选择离子监测(SIM)模式，SIM 监测离子质荷比(m/z)为45，44，29，17，其中m/z 45为定量离子。

1.3 试验方法

试验所用国内生产的再造烟叶样品共20 个(1#～20#)，均为片状。

按YC/T 31－1996《烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法》中的方法制备再造烟叶样品并测定水分。

称取1.000 0 g再造烟叶样品于50 m L 具塞三角瓶中，加入15.0 m L甲醇，涡旋振荡5 min。收集上层清液，经有机相滤膜过滤，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件对甲酰胺标准溶液进行测定，其色谱图见图1。按试验方法对再造烟叶阳性样品进行分析，其色谱图见图1。

图1 甲酰胺标准溶液和阳性样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of formamide standard solution and the positive sample

2.2 仪器工作条件的选择

2.2.1 色谱柱

试验分别考察了 HP-5 毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m，0.25μm)、DB-Innowax毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m，0.25μm)和DB-Wax毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m，0.25μm)对甲酰胺分离效果的影响。结果发现:使用HP-5毛细管色谱柱时，甲酰胺的峰形不对称，不利于定量；使用DB-Innowax毛细管色谱柱时，甲酰胺的峰形稍微改善，但效果不太明显；使用DB-Wax毛细管色谱柱时，甲酰胺的峰形对称，符合定量要求，且能较好地分离甲酰胺和其他未知化合物。试验选用DB-Wax毛细管色谱柱。

2.2.2 质谱条件

在全扫描模式下扫描m/z 16～50内的离子碎片，甲酰胺的质谱图见图2。

图2 甲酰胺的质谱图Fig.2 MS spectrum of formamide

由图2 可知:甲酰胺的主要离子碎片m/z 为45，44，29，17，选择这些主要离子碎片进行选择离子测定，其中响应最强的离子碎片(m/z 45)作为定量离子。甲酰胺在电子轰击电离作用下，C－H、C－N极易断裂，形成CH2NO(m/z 44)、CHO(m/z 29)、NH3(m/z 17)的碎片。试验选择的质谱条件见1.2节。

2.3 样品前处理方法的选择

2.3.1 提取溶剂

甲酰胺是小分子极性化合物，根据“相似相溶”原理及气相色谱-质谱仪的溶剂适应性，并参考文献[16-18]，选取甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇和二氯甲烷等5种极性溶剂作为提取溶剂进行考察。按试验方法采用上述提取溶剂对再造烟叶样品15#进行分析，平行测定3 次。结果表明:采用甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇和二氯甲烷作为提取溶剂时，甲酰胺的测定 值 依 次 为17.20，16.53，13.26，15.74，11.48 mg·kg－1。

对上述5种提取溶剂所得提取液的基质进行考察。结果表明:基质干扰均较小。甲醇对甲酰胺的提取效率最高，试验选择提取溶剂为甲醇。

2.3.2 提取溶剂的用量

试验考察了提取溶剂甲醇的用量依次为5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，20.0 m L 时 对 甲 酰 胺 测 定 值 的影响，结果见图3。

由图3可知:当甲醇用量为5.0～12.5 m L 时，随着甲醇用量的增加，甲酰胺的测定值逐渐增大；继续增加甲醇用量，甲酰胺的测定值变化不明显。综合以上结果，同时为了保证提取完全，试验选择提取溶剂甲醇的用量为15.0 m L。

图3 甲醇的用量对甲酰胺测定值的影响Fig.3 Effect of amount of methanol on determination value of formamide

2.3.3 提取方法和提取时间

甲酰胺的提取可采用顶空提取、微波提取、超声波提取和索氏提取。顶空提取适合于提取空气(气态)中的甲酰胺，后3种方法常用于提取固态和液态介质中的甲酰胺[8-18]；微波提取和索氏提取易造成目标物损失；超声波提取的效果最好，但需要较长的时间。涡旋振荡提取是一种新兴的提取方法，其振荡频次可达到2 000 r·min－1，是普通旋转振荡的10倍，可极大地缩短振荡时间、提高提取效率。试验考察了提取时间依次为1，2，3，5，7，10，15，20，30 min时超声波提取和涡旋振荡提取对甲酰胺测定值的影响，结果见图4。

图4 提取方法和提取时间对甲酰胺测定值的影响Fig.4 Effect of extraction method and extraction time on determination value of formamide

由图4 可知:超声波提取的提取时间小于15 min时，甲酰胺的测定值随提取时间的延长而增大；超声波提取的提取时间大于15 min时，甲酰胺的测定值变化不明显；涡旋振荡提取的提取时间小于3 min时，甲酰胺的测定值随提取时间的延长而增大；涡旋振荡提取的提取时间大于3 min时，甲酰胺的测定值变化不明显。为了节省时间，提高提取效率，同时保证提取完全，试验选择涡旋振荡5 min进行提取。

2.4 标准曲线和检出限

用甲醇稀释1 000 mg·L－1的甲酰胺标准储备溶液，得到0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 mg·L－1的甲酰胺标准溶液系列，按仪器工作条件对上述甲酰胺标准溶液系列进行测定，并绘制标准曲线。结果表明:甲酰胺的质量浓度在0.1～5.0 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程为y＝2.035×104x＋7.424×104，相关系数为0.999 0。

分别按3倍和10倍信噪比计算甲酰胺的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果依次为0.01，0.04 mg·L－1。

2.5 重复性

为了考察方法的重复性，对再造烟叶样品15#进行重复3 d的分析，每天进行6次平行测定。结果表明:日内相对标准偏差(RSD)为2.5%～3.0%，日间RSD 为4.4%。

2.6 回收试验

按试验方法对再造烟叶样品15#进行加标回收试验，计算回收率，结果见表1。

表1 回收试验结果Tab.1 Results of test for recovery

由表1可知:回收率为92.5%～105%。

2.7 样品分析

按试验方法对20个再造烟叶样品进行分析，在部分样品中检出了甲酰胺，结果见表2。将本方法与常规的气相色谱法(配FID)[7]进行比对试验，结果见表2。

由表2可知:检出率约为30%，测定值在4.11～33.97 mg·kg－1之间。阳性样品的两组测定结果经t检验后发现:t＝0.498，小于1.812(置信区间小于0.05)。这说明两种测定方法无显著性差异。

表2 样品分析结果Tab.2 Analytical results of the samples mg·kg－1

在日常的大量样品分析中，发现了常规的气相色谱法假阳性高的问题。气相色谱法和气相色谱-质谱法同时分析的486个样品中有35个样品用气相色谱法分析为阳性，而用气相色谱-质谱法分析为阴性，气相色谱法的误检率为7.2%。这是由于再造烟叶作为植物再加工产品，生产过程中可能在烟叶中加入了助剂、填料、涂布液等物质，导致样品提取液的基质较为复杂，气相色谱法单纯地采用保留时间进行定性，提取液中的色素等可能在相同的时间出峰，造成了分析的假阳性。气相色谱-质谱法在锁定保留时间的同时，还获取了甲酰胺的离子碎片及离子碎片丰度比信息，只有这3个信息均与标准样品一致才会被定义为甲酰胺，因此极大地排除了分析的假阳性。

本工作采用气相色谱-质谱法测定再造烟叶中甲酰胺的含量。本方法操作简单、效率高、适合于再造烟叶中甲酰胺的测定。