H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡的研制

李 维，张 婷，王 飞，詹爱军，王 超，陈 勇

（深圳市检验检疫科学研究院，广东 深圳 518010）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A 型流感病毒（AIV）引起的病毒性烈性传染病，是目前危害世界及我国养禽业的最重要的疫病之一［1-2］. H9 亚型病毒为低致病性毒株，致死率虽然较低，但感染会引起禽类的呼吸道症状以及产蛋率的下降，是一种严重危害禽类养殖行业生产的病原微生物［3-5］.及时准确地对H9亚型禽流感病毒感染进行诊断，是针对性诊治从而降低经济损失的关键环节.

目前，国内外开展禽流感的检测方法较多，主要分为传统方法与分子生物学方法，传统方法多为病毒分离培养和血清学诊断，其不足之处在于操作繁琐且结果重复性不好［6-9］；分子生物学检测，包括RTPCR 检测法、实时荧光RT-PCR（real time RT-PCR）检测法、基因芯片检测法等，分子生物学检测方法的应用也非常迅速，但对实验条件要求高，所需仪器设备昂贵，不易在基层兽医部门推广［10-11］.

本实验室以抗禽流感病毒核蛋白单克隆抗体为基础，应用胶体金免疫层析技术，研制了H9 亚型禽流感病毒的特异性胶体金层析检测卡，为禽流感病毒的快速诊断及流行病学调查提供了一种特异性强、灵敏度高、方便快捷的有效工具.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗体、抗原与血清

H9 亚型禽流感病毒HA 单克隆抗体，源自扬州大学动物医学学院传染病与预防兽医重点实验室；H9亚型AIV 的阳性血清和阴性血清、禽流感病毒H9N2 抗原、H1N1 抗原、H3N2 抗原、NDV 抗原，IBDV 抗原，IBV 抗原、ILTV 抗原购自哈尔滨兽医研究所国家动物工程中心.

1.1.2 试剂耗材

牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20，Tritonx-100、Polyvinylpyrrolidone（PVP-40）为sigma 公司产品；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O），购于国药集团化学试剂有限公司；羊抗鼠二抗购于长沙博优生物科技有限公司，ABGAM-0500；柠檬酸三钠、叠氮钠（NaN3）及一些常用化学试剂购于上海化学试剂公司；硝酸纤维膜（Nitrocellulose membrane）购于waterman 和Schleicher&Schuell 公司；玻璃纤维膜（glass fibre）、吸水纸（absorbent paper）、支持板均购于上海金标生物科技有限公司.胶体金优化试剂：胶体金免疫层析优化剂套装（SDS-L、SDS-F、L-30、L-90D），购自深圳逗点生物技术有限公司.

1.1.3 胶体金常用试剂

1%HAuCl4水溶液、柠檬酸三钠水溶液、0.2 mol/L K2CO3、10% BSA、10% PVP-40、10% Tween-20、10% 叠氮钠、玻璃器皿清洁液、金标垫处理液、样品垫处理液、抗原稀释液、二抗稀释液、0.2 mol/L PB（pH7.4）、5%二氯二钾硅烷的氯仿溶液.

1.2 禽流感病毒胶体金检测方法

1.2.1 胶体金的制备

取用新制超纯水100 mL 置于圆底烧瓶内，上接冷凝管置于磁力加热搅拌器上加热至煮沸，煮沸后继续加热3 min.

之后准确吸取2 mL 1%氯金酸水溶液，加入圆底烧瓶内，继续加热煮沸3 min 后，再准确吸取1%柠檬酸三钠水溶液3.2 mL，迅速加入圆底烧瓶中，开启搅拌，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠溶液加入后很快变灰色，续而颜色继续加深转成黑色，随后逐渐转为酒红色，整个过程约2～3 min.待溶液变成稳定的酒红色后，继续加热煮沸15 min 后置于室温下冷却.

待胶体金悬液冷却至室温后，加入0.02%的叠氮钠，经一次性灭菌滤器过滤，置于洁净玻璃瓶中4 ℃冰箱保存备用.

1.2.2 免疫胶体金的制备

1.2.2.1 胶体金标记抗体的最适pH

由于不同的pH 环境会影响抗体与胶体金颗粒的结合，因此将胶体金悬液调节成不同的pH，通过加入过量的待标记H9 亚型禽流感单克隆抗体，考查标记抗体的活性和特异性.实验将胶体金溶液pH 分别调整为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，加入浓度为50μg/mL 的禽流感病毒单克隆抗体，混匀静置15 min 后观察反应体系.

1.2.2.3 胶体金与待标记抗体用量比例的确定

本研究采用经典NaCl 滴定法确定最佳标记量，将待标记的抗体分别稀释为10、15、20 、25、30、35、40 µg/mL，各取5 µL，顺序加入一系列装有0.5 mL 胶体金悬液的试管中，另设一不加抗体的对照管.混匀静置15 min.于上述管中分别加入0.1 mL 10% NaCl 溶液，混匀，静置20 min，观察结果.

1.2.2.4 抗体的胶体金标记

按照得到的最佳抗体标记条件标记抗体，经离心后弃上清，沉淀加入金标复溶液复溶后，4 ℃保存备用.

1.2.3 金标检测卡的制备

1.2.3.1 金标膜的制备

胶体金标记物制备后，用BioDot 的XYZ3050 喷金系统将其按照2.0、2.5、3.0 µL/cm 的喷量均匀喷涂在金标结合垫上后，将其移入真空干燥箱内，真空干燥2 h，加入干燥剂，用铝箔袋密封保存于4 ℃冰箱中.

1.2.3.2 硝酸纤维素反应膜的制备

采用抗原、二抗稀释液，将羊抗鼠二抗配分别配制成2、1.5、1、0.5 mg/mL 溶液，用BioDot 的XYZ3050划膜系统将其包被至硝酸纤维素膜（NC 膜）的质控线（C 线）位置；未用于标金的另一株H9 亚型禽流感病毒包被抗体分别配制浓度为2.4、2.1、1.8、1.5 mg/mL 的溶液，用BioDot XYZ3050 划膜系统将其包被至硝酸纤维素膜的检测线（T 线）位置，于相对湿度为30%以下的37 ℃干燥车间干燥48 h 后待用，得到具有检测线和质控线的包被膜.

1.2.3.3 检测卡的组装

将NC 膜平展贴于粘性底板的中央，胶金垫平贴于NC 膜T 线的下方，重叠NC 膜0.3 cm，样品垫再平贴于胶金垫上，重叠胶金垫一部分.将吸水纸平放于NC 膜C 线的一端，重叠NC 膜0.3 cm.并于CM4000切条机上，将其切成3 mm 宽的检测试条，用铝箔袋密封保存于4 ℃冰箱中.

1.2.3.4 预期反应状况及结果

如果被检样品中含有禽流感病毒抗原，抗原首先在金标垫上与金标单抗结合形成“禽流感病毒-金标单抗”复合物，该复合物继续在毛细作用下向上泳动，与固定在检测线上的禽流感病毒多抗结合形成“禽流感病毒多抗-禽流感病毒-金标禽流感病毒单抗”复合物的富集体，从而呈现红色；没有结合抗原的金标单抗继续向前泳动，与固定在阴性对照线上的羊抗鼠二抗形成“羊抗鼠二抗-金标抗禽流感病毒单抗”复合物富集体（质控线），从而呈现红色.检测线和质控线同时显色的为阳性反应，只在质控线出现红色条带为阴性反应.质控线内未出现红色条带，表明检测结果无效.

1.3 禽流感病毒胶体金检测卡的性能测定试验

1.3.1 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡灵敏性评估试验

以H9N2 亚型禽流感病毒试验抗原作为待测样品来测定的检测H9 亚型禽流感病毒检测卡的灵敏度.将64 HA unit 的禽流感病毒H9N2 亚型AI 试验抗原用pH 为7.4 的0.02 M PBS 缓冲液进行2 倍梯度稀释，使其终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016 HA unit，并设置空白样，分别置于H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡上进行检测.检测步骤：检测前先将待检测样品恢复至室温（25℃），用精确移液器取待检测样品65 µL 垂直缓慢滴入H9 亚型禽流感病毒检测卡的加样端，5 min 后判读结果.

1.3.2 禽流感病毒胶体金检测卡特异性评估试验

将H9 亚型禽流感病毒亚型和其他常见呼吸道病毒，包括家禽的呼吸道病毒（新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）），人呼吸道病毒（副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、冠状病毒）等相同症候群病毒，用pH 为7.4 的0.02 M PBS 缓冲液配制为较高的浓度，分别用精确移液器取65 µL 垂直缓慢滴入禽流感病毒检测卡的加样端，5 min 时判读结果.

1.3.3 禽流感病毒胶体金检测卡小规模田间试验

采集田间试验样品，包括家禽棉拭子样品179 份，采集医院临床样品21 份，对样品同时进行禽流感病毒胶体金检测卡的检测和荧光RT-PCR 检测，确定所建立方法的实用性.

2 结果

2.1 免疫胶体金的制备

2.1.1 胶体金标记抗体的最适pH

将胶体金调成不同的pH 值，加入过量的待标记的H9 亚型禽流感单克隆抗体（50 µg/mL），考察标记抗体的活性和特异性.结果见表1.

表1 H9 亚型最适抗体标记pH 值的确定

由表1 可知，胶体金标记H9 亚型禽流感抗体的最佳pH 值为9.5 时，其活性、特异性较好.

2.1.2 胶体金与待标记抗体用量比例的确定

采用经典NaCl 滴定法确定最佳标记量，将待标记的抗体逐级稀释，各取5 µL，顺序加入一系列装有0.5 mL 胶体金的试管中，另设一个不加抗体的对照管.混匀，15 min 后，再于上述管中分别加入0.1 mL 10% NaCl 溶液，混匀，静置20 min，结果见图1 和表2，可以看出，抗体加入量少于25 µg 的，体系难以维持良好的稳定性.因此胶体金标记H9 亚型禽流感抗体最适蛋白标记量为 25 µg/mL.

图1 胶体金标记抗体最适量的确定

表2 胶体金标记H9 亚型禽流感抗体最适量的确定

2.1.3 抗体的胶体金标记

取25 mL 胶体金于50 mL 离心管中，加入0.2 M K2CO3调节PH 值至9.5，充分混匀.取H9 亚型禽流感抗体625 µg 用0.01 M pH 7.4 PBS 稀释后加入50 mL 离心管中，混匀，静置30 min.加入2.5 mL 10% BSA溶液于50 mL 离心管中，混匀，静置30 min .离心（4 ℃，8 500 g，30 min）后去上清，加入2.5 mL 胶体金标记物稀释缓冲液. 4 ℃保存备用.

2.2 金标复溶物喷量与禽流感病毒抗体、羊抗鼠二抗稀释倍数的确定

金标复溶物通过BioDot 的XYZ3050 喷金系统吸附于玻璃纤维，在其它条件不变的情况下，将制作成的检测卡相对于一系列稀释的禽流感病毒标准抗原进行方阵试验.

表3 检测线包被浓度和喷量的确定

由表3 可知，H9 亚型禽流感病毒包被抗体最佳工作浓度分别为2.1 mg/mL，喷量2.5 µL/cm 时得到的检测线和质控线条带的清晰，灵敏度高，是较为合适的稀释度.

不同浓度的禽流感病毒抗体、羊抗鼠二抗通过BioDot 的XYZ3050 划膜系统吸附于硝酸纤维素膜上，在其它条件不变的情况下，将制作成的检测卡相对于一系列稀释的禽流感病毒标准抗原进行方阵试验，经方阵试验确定羊抗鼠二抗的最佳工作浓度为1 mg/mL，划膜参数设定 1 μL/cm.

2.3 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡灵敏性结果

将H9N2 标准抗原进行连续的倍比稀释，采用所研制的H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡进行检测，其检测结果如表4 所示.

表4 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡不同样品浓度的检测结果

从检测结果中可以得出H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡检测标准的H9N2 亚型流感病毒的灵敏度为0.5 HA unit.

图2 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡测试结果

2.4 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡特异性结果

采用所研制的H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡，对引起人的呼吸道症候群相关且与流感相近的病毒进行检测，检测结果全部为阴性.对流感相近且引起家禽呼吸道症候群的病毒进行检测，检测结果也全部为阴性.检测阴性基质，包括正常人的鼻咽拭子、痰液、正常家禽的棉拭子、正常的家禽组织，检测结果全部阴性.表明检测卡不受基质的影响，且检测结果特异性强.其检测结果如表5 所示.按照本方法制备的H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡能用于检测H9 亚型禽流感病毒，与常见的呼吸道病毒IBV、呼肠孤病毒、NDV 之间没有交叉反应.

表5 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡交叉反应检测结果

2.5 禽流感病毒胶体金检测卡小规模田间试验结果

对采集田间试验样品200 份，全部同时进行H9 亚型禽流感病毒胶体金检测卡的检测和荧光RT-PCR检测，两者的检测结果一致，表明检测卡的实用性强.

表6 H9 亚型禽流感病毒胶体金检测法与荧光RT-PCR 检测法对比结果

3 讨论及结论

本课题研制的禽流感病毒胶体金快速检测卡具有灵敏度高、特异性强的特点，利用本试条对副粘病毒新城疫标准抗原、传染性喉气管炎病毒、法氏囊病毒和传染性支气管炎病毒、H5 亚型禽流感病毒、H1亚型禽流感病毒等与H9 亚型禽流感病毒相近的家禽致病抗原进行检测，其结果均为阴性；本试条检测时间短，5 min 即可判读结果，这与传统的鸡胚分离、血清学诊断技术以及PCR 等分子生物学诊断技术相比，不仅大大缩短检测时间，还提高了检测速度.检测灵敏度高，可达到1 HA unit，可以满足现场H9 亚型禽流感病毒的快速检测需求，非常适宜在广大基层单位推广和应用.