microRNA-16-5p对超急性期脑梗死的诊疗价值

邹文婧，周玉爽，李 杰，高盼盼，李金泽

(吉林大学第二医院 麻醉科手术室，吉林 长春130041)

超急性期脑梗死是脑缺血导致的一种急性并发症，是目前中国所有疾病中第二位致死性疾病[1]，主要治疗手段包括溶栓治疗和血栓切除治疗，但是上述治疗只限于发病6 h之内，否则会出现严重的缺血再灌注损伤[2]。因此快速的诊断此类疾病将决定患者当前治疗手段和远期预后。血清诊断标志物被认为是当前能快速提供疾病诊断消息的一类临床检验方法。和传统的血清诊断标志物相比，非编码RNA(微小RNA，microRNA)已经被证实在脑梗死疾病初期呈现差异性表达[3]，并且有作为脑梗死诊断血清标志物的潜在可能，但因脑梗死发病阶段和发病原因较多，尤其是超急性期脑梗死目前尚无有效的血清标志物发现。故本文通过对microRNA-16-5p进行高通量信息分析及血清标本验证来明确其在超急性期脑梗死中的诊疗价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2017年1月—2018年6月就诊于吉林大学第二医院超急性期脑梗死患者41例。入选标准：中风发作至入院时间少于6 h。排除标准：伴随严重的心血管疾病、血液疾病、感染及恶性肿瘤患者。其中男28例，女性13例，全部患者平均年龄62.1±13.9岁，身高168.3±6.9厘米，体重74±8.8公斤。对照组为同期在门诊就诊的健康体检患者。本实验经吉林大学学第二医院伦理委员会审核并批准，所有入组患者对本项目知情同意并允许血液样本为科研所用。

1.2 高通量生物信息分析方法mircroRNA基因芯片表达结果GSE86291来源于GEO数据库。其中GSE86291包含7例超急性期脑梗死患者和4例健康对照组血液。通过GEO2R软件进行差异表达统计分析，差异表达筛选标准为(差异倍数在2倍以上及P<0.05)。miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/search)提供mircroRNA调控的下游靶基因预测。基因本体分析(GO analysis)对下游靶基因进行计算，京都基因及基因组百科全书信号通路分析(KEGG analysis)对靶基因进行信号通路的预测。基因信号气泡图应用R语言 affy和limma数据包处理后绘制。

1.3全部患者外周血液RNA采用microRNA专用快速提取试剂盒提取(BIOTEKE 试剂盒)，micro RNA逆转录为cDNA采用BIOTEKE miR RNA cDNA第一链合成试剂盒。实时定量PCR操作仪器为ABI公司生产的7500 Real time PCR机器，采用BioTeke miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)试剂盒，每组样品均设3 个重复。

2 结果

2.1 GSE86291芯片分析结果对2006个芯片进行检测发现3个差异下调表达的基因，28个差异上调表达的基因，1975个无明显差异表达的基因。其中microRNA-16-5p为差异下调表达的基因，P值为0.02416，差异表达倍数为4.78倍。

2.2 基因本体分析结果显示生物过程集中在蛋白质磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号传导、蛋白质泛素化、细胞迁移负调控和泛素依赖性蛋白分解代谢过程。细胞组成集中在细胞质、胞质溶胶、核质、突触和循环内质。分子功能集中在蛋白结合、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、泛素蛋白转移酶活性和蛋白激酶活性，见表1和图1。

表1 基因本体分析结果

注：基因本体分析结果：生物过程，细胞组成，分子功能

图1 基因本体分析结果

图2 京都基因及基因组百科全书信号通路

2.3 京都基因及基因组百科全书信号通路分析MAPK信号通路、肿瘤通路、神经营养因子信号通路、PI3K-Akt信号通路和调节干细胞多能性的信号通路。信号通路气泡图见图2，其中渐变色代表p值，黑点的大小代表基因数。

2.4在获取的急性期脑梗死中患者及健康患者血液标本验证，microRNA-16-5p 在2组血液标本中呈现差异性表达，RT-PCR检测结果发现 microRNA-16-5p在脑梗死组和对照组之间呈现差异性低表达，差异表达倍数2-ΔΔCt=2.107差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

急性脑梗死是因脑血管急性闭塞而导致脑组织缺血缺氧性疾病，目前占中国因卒中而死亡的第一位。而超急性脑梗死一经诊断需要紧急临床干预，其黄金治疗时期在梗死后1-6 h内。目前针对脑梗死的诊断措施尚无快速有效的方法，一般多在发生症状后先行头部CT检查排除脑出血后再行头部核磁共振平扫加弥散检查来确认脑梗死[4]。但核磁共振弥散检查往往是根据缺血缺氧脑组织因能量代谢异常而导致水分子弥散受到限制来诊断脑梗死，但是脑缺血到发生血管源性水肿一般需要5 h左右，故对脑梗死的早期诊断有一定的延误。

血清标志物因检查方便且迅速被认为能快速提供脑梗死诊断信息。一些研究报道白细胞介素-10，肿瘤坏死因子-α，C反应蛋白，D二聚体，β2-微球蛋白、胆碱酯酶[5-7]对脑梗死的早期诊断有一定的价值。但是这些诊断标志物特异性差，而且这些物质是针对炎症反应进行检测，一般炎症反应均是在脑组织缺血缺氧一段时间后方会出现体内炎症介质的异常改变，故不适合快速诊断。因此一些研究开始关注脑组织在缺血后自身分泌的异常物质进行检测来快速诊断脑梗死。其中microRNA-16被认为是一种能够提供脑梗死诊断信息的一类非编码RNA[8]。其被报道是在脑梗死后患者血清中出现的一种低表达的血清标志物。

通过我们对脑梗死患者血液的检测我们发现microRNA-16-5p确实在脑梗死患者中表达较正常人要低，可能是在脑组织缺血后自身释放出的物质。而对microRNA-16-5p进行下游调控分析我们发现，其控制的白细胞介素7，肿瘤坏死因子受体，说明在炎症反应前microRNA-16-5p已经出现异常，从而引起机体炎症反应的发生，说明检测microRNA-16-5p变化对脑梗死的诊断价值可能早于对炎症因子的诊断。而基因本体分析提示蛋白质磷酸化可能是microRNA-16-5p调控下游基因的主要生物过程，基因百科全书信号通路分析均锁定在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是主要的信号通路。而MAPK信号通路已被很多研究证实和急性脑缺血相关[9,10]。因此microRNA-16-5p很可能是在脑梗死早期即出现的一种发生变化的血清标志物。

总之，microRNA-16-5p已在我们所搜集的全部脑梗死超急性期患者外周血清中呈现差异性低表达，诊断阳性率较高。这种在脑梗死超急性期内即发生改变的非编码RNA有可能在脑梗死病人的最早期被临床所检测出来，为脑梗死超急性期患者的后续治疗提供宝贵的治疗时间。