利用TaqMan微流控阵列同步检测多种动物源性成分

虞惠贞，侯寒黎，尹文秀，张荃，孙超，张明哲，张晓峰，苗丽，吴姗*

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院，杭州 310012；2.钱江海关，杭州 310007；3.郑州海关技术中心，郑州 450003）

经济利益驱动下的商品掺假现象层出不穷，其中食品掺假问题更是引起消费者的普遍关注。近年来，肉和肉制品掺杂掺假事件频频被媒体曝光，不法分子将价格相对低廉的猪肉、鸡肉、鸭肉，甚至不宜食用的狐狸肉、马肉等冒充牛肉、羊肉、驴肉进行销售。鱼及鱼类制品市场也鱼龙混杂，用食用后导致腹泻的“油鱼”（学名“异鳞蛇鲭”或“棘鳞蛇鲭”）冒充鳕鱼；用淡水虹鳟替代深海大西洋鲑鱼等。鱼肉加工成肉块或肉糜之后，从外形上较难进行种类鉴定，若再进一步加工成鱼罐头、鱼松、鱼肠、鱼丸等深加工产品则掺假掺杂的概率更高。

物种的特异性核酸序列检测是实现食品真伪鉴别常用的手段，如普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）及实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RTPCR）方法都是目前较常用的鉴别方法。虽然较普通PCR方法已经省却了电泳检测的步骤，但RTPCR技术也存在检测通量的局限，如一般检测3重或者4重PCR就达到了该方法检测通量的极限。若一味追求检测通量，同一RT-PCR反应体系中加入过量的引物探针组合，导致扩增效率降低的同时，往往会引发引物的错配，最终导致检测的灵敏度和准确度双双下降。

TaqMan微流控阵列（TaqMan®array microfluidic cards）技术是将单重荧光定量PCR（individual RTPCR,IRTP）的引物和探针固定在一个反应孔中，再将众多不同引物探针的反应孔整合在一张芯片上形成一个反应阵列，可同时对12～384个样本，针对不同目标基因进行检测。根据引物探针组合的多少，同步检测的基因达数十或几十种不等。TaqMan微流控阵列技术保留了RT-PCR的灵敏度和准确度，同时又可同步、快速地检测多个目标基因，但该技术的检测成本和RT-PCR及测序比较并无优势可言。目前，该技术较广泛用于医学疾病的诊断，如ONYANGO等[1]针对中枢神经系统中的急性感染开发了一种可检测21种病原体的TaqMan微流控阵列检测方法；LIU等[2]则开发了可用于同时检测19种肠道病原体的TaqMan微流控阵列板。此外，该技术还被用于耐药突变的研究[3]、髓母细胞瘤亚群分析[4]、癌变细胞[5-6]和干细胞[7]内的表达差异性分析等。PHOLWAT等[3]开发了TaqMan微流控阵列溶解曲线技术，即同时应用探针和溶解曲线2种方法进行检测，通过2种结果的比对，对试验进行双重验证，但该方法在医学以外的领域应用尚少。本研究将TaqMan微流控阵列技术应用到食品真伪鉴别检测中，将不同物种特异性的引物探针集合在同一个TaqMan微流控阵列上，实现多物种成分同步检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所涉及的样品信息如表1所示。

1.2 样品的DNA抽提

1.2.1 动植物样品DNA的提取

动植物样品的前处理：将剪碎的固体样品放入带有磁珠（Φ=3 mm，Sigma公司，美国）的2 mL试管（Sarstedt公司，德国）中，用FastPrep®-24振荡研磨仪（MP Biomedicals公司，美国）以5 500 r/min振荡研磨20 s，重复4次。

取上述研磨后的样品50 mg，用FF3750抽提试剂盒（Promega公司，美国）进行DNA抽提，操作步骤参照试剂盒说明书进行，最后抽提得到DNA固体样品，溶解在30 μL去离子水中，后续可根据实验需求将DNA溶液稀释至不同浓度。

表1 用于检测的样品信息Table 1 Sample-tested information

1.2.2 微生物样品DNA的提取

将培养至对数生长期的菌液离心，去上清液，用QIAamp DNA迷你试剂盒（Qiagen公司，德国）提取沉淀中菌的DNA，操作步骤参照试剂盒说明书进行，最后将得到的DNA根据浓度需要溶解在20 μL去离子水中，后续可根据实验需求将DNA溶液稀释至不同浓度。

DNA浓度用NanoDrop ND-1000紫外可见光分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）进行测定。

1.3 单重荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应体系如下：10 μLTaqMan 2×PCR反应混合物，上游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，探针（10 pmol/μL）0.4 μL，调节为 5～10 ng/μL 的DNA溶液1 μL，用ddH2O补足体积至20 μL。采用ViiATM7荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）进行反应，反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃延伸60 s，40个循环。每个反应重复4次。检测结果用循环阈值（cycle threshold,CT）表示。在灵敏度分析中检测得到的CT≤35时为阳性，4次结果中3次或3次以上结果为阳性，则表示可检测到该浓度。

反应所用的引物和探针由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，探针的5´端用6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein,FAM）标记，3´端以BHQ1为淬灭基团。

1.4 TaqMan微流控阵列设计

本研究中TaqMan微流控阵列采用的是384孔板的TaqMan低密度阵列（TaqMan low density array,TLDA）（Applied Biosystems公司，美国），每个板上有8列，每列含48孔，每个基因占2个孔，可检测24种（类）对应的物种。在对微流控阵列板进行特异性验证时，板上设置1列阴性对照（Ctrl），即该列的样品不含目标物种的DNA，其他7道（S1～S7）用于样品检测。在对微流控阵列板进行灵敏度验证时，不设阴性对照列，Ctrl列也作为检测列（S0）（图1）。检测的目标物种见图1，包括10类哺乳动物、7种禽类、5种鱼类，以及1个“真核生物”和1个“哺乳动物”的检测孔。“真核生物”可作为检测DNA质量的内参基因；“哺乳动物”可作为当所列物种都为阴性，唯有“真核生物”和“哺乳动物”为阳性时的筛选基因，为下一步检测缩小物种范围。此外，需要说明的是，除了“哺乳动物”和“真核生物”的引物探针外，阵列中其他的引物探针组合所针对的也可能并非一个物种，而是几个物种，如“鳕鱼”的引物探针，可同时检测大西洋鳕、太平洋鳕等。本研究所设计的引物探针所对应的物种以及所有物种的引物探针序列见表2。

1.5 TaqMan微流控阵列检测步骤

图1 TaqMan低密度阵列板的设计Fig.1 Layout of TLDA

微流控阵列检测采用ViiATM7荧光定量PCR仪和TaqPath ProAmp预混液（Applied Biosystems公司，美国）。将80 μL预混液和相应的20 μL DNA混合，加入每一个检测列，使得每一个孔的引物探针浓度和DNA质量浓度与单重荧光定量PCR在数量级上保持一致，如以S1列为例，在单重目标荧光定量PCR反应中加入10 ng的目标物种DNA，在S1列中要使每个反应孔的目标物种DNA为10 ng，则需要将7种检测目标物种（表3）的DNA质量浓度均调整为80 ng/μL左右，每种各取3 μL，其他列的以此为例对取样的浓度和体积进行计算。但“哺乳动物”和“真核生物”涉及多物种，因此“哺乳动物”和“真核生物”例外，无法调节加样板浓度与荧光定量PCR的一致。加样后，以366g离心2次，每次1 min；封口，放入ViiATM7荧光定量PCR仪进行反应。单重荧光定量PCR反应程序如下：45℃去污染10 min；94℃预变性10 min；94℃变性30 s，60℃延伸1 min，45个循环。

1.6 TaqMan微流控阵列重复性与特异性验证

准备1组非目标物种成分的DNA样品（N），作为阴性对照，加入Ctrl列；另外准备6组DNA样品，根据DNA样品所含物种加入到对应的列（S1～S6）中（表3）。S1和S2、S3和S4、S5和S6分别加入了相同目标物种的DNA，但在22种（类）目标物种外，在S2、S4、S6列中又增加了另外4种非目标物种的DNA，包括1种哺乳动物（梅花鹿）、1种鸟类（麻雀）、1种鱼类（细鳞壮鳕）和1种植物（水稻），以此检测非目标DNA是否会干扰目标DNA，从而影响检测结果。而S7列中加入的物种皆为22种（类）目标物种以外的物种（表3），理论上只能在哺乳动物和真核生物的检测孔中得到阳性结果。哺乳动物和真核生物由于涉及的检测物种较多，而检测的目标基因在不同物种中的拷贝数也未必相同，因此，对于哺乳动物和真核生物的检测孔，不进行重复性验证。重复检测3块板。在进行微流控阵列的重复性和特异性验证时，每个目标物种的DNA在每个加样孔的质量为10 ng左右。

表2 本研究中引物和探针序列Table 2 Sequences for primers and probes used in this study

1.7 TaqMan微流控阵列灵敏度验证

比较TaqMan微流控阵列和单重荧光定量PCR（IRTP）的检测灵敏度。考虑到一个DNA样品中涉及的物种越多，不同的DNA间会存在竞争和干扰，从而影响目标物种PCR反应的扩增效率，因此，在对微流控阵列进行灵敏度验证时，我们采取了如表4所示的加样组合，使一个加样孔中涉及的物种减少至5～6种，但若再减少物种数量，则一块加样板内无法检测所有的目标基因，且检测成本也会增大。设置的质量浓度低限参考IRTP的检测低限，根据该物种在IRTP中的检测低限，设置1个检测值，同时再设置一个高于该值1个数量级的检测值，以黄牛检测为例，设置了0.01 ng/μL（IRTP的检测低限值）和0.1 ng/μL（高于检测低限1个数量级的值）2个值。只有“马”和“狗”例外，这2个物种的IRTP检测低限都为1.0 ng/μL，但设置的检测值为1.0和0.1 ng/μL。这一方面是由于检测用的微流控阵列板的数量有限，另一方面是在进行重复性和特异性验证时使用的质量浓度为10 ng/μL，因此可直接借鉴该结果。微流控阵列的加样质量浓度如表4所示，同一质量浓度下重复4次检测（1块板内重复2次，检测2块板），检测得到的CT≤35时为阳性，4次中3次或3次以上结果为阳性，表示可检测到该质量浓度。

表4 用于TaqMan微流控阵列灵敏度检测的DNA样品组合Table 4 DNAsample combination used for TLDA sensitivity detection

1.8 数理统计

试验重复性的统计分为板内重复性和板间重复性。板内重复性统计时，假设S1和S2列、S3和S4列、S5和S6列，两两间没有差异，即每个目标物种都假设重复4次，用标准差（s）和变异系数（CV）表示重复性；板间的重复性则采用单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TaqMan微流控阵列重复性验证结果

因每个加样列有2个重复孔，同时每个样本重复加入2列，如“黄牛、水牛、骆驼、绵羊、家猪”同时加入S1和S2列，但不同的是S2列除了包含上述目标物种，还包含4个非目标物种“梅花鹿、麻雀、细鳞壮鳕、水稻”，这是为了验证该方法的特异性而添加的，但在重复性验证中，假定S1和S2列没有区别，即每个目标物种板内重复4次；同时重复3块板，因此板间重复3次。

标准差和变异系数的值都能说明板内相同列间的重复性。由表5可知，一般情况下标准差较高的，对应的CV值也较高，以黄牛检测的值为例：TLDA1（表示第1块TLDA板上的验证，以此类推）中标准差为0.19，对应的CV值为0.84%；TLDA2中标准差为0.43，对应的CV值为1.92%；TLDA3中标准差为0.39，对应的CV值为1.85%。比较同一个目标物种的检测结果时，由于各板间CT值的平均值都较为接近，标准差和CV值都可说明板内列间的重复性优劣，因此仍以黄牛检测为例，TLDA1板内列间的重复性优于TLDA3，TLDA3优于TLDA2。但在比较不同检测目标的检测结果时，由于不同引物探针的扩增效率不同，即便在目标DNA质量浓度相同的情况下，得到的CT值的平均值差异也可能较大，此时单纯以标准差比较重复性优劣，则较难说明问题。如表5中TLDA1板内黄牛和羊检测结果的标准差皆为0.19，但CV值分别为0.84%和0.62%。标准差的大小和均值相关，而变异系数是一个量纲一的量，所以变异系数更适合用于比较2组均值不同的数据。因此，当比较不同检测目标时，如比较TLDA1板内黄牛和羊检测结果的重复性优劣时，CV值显示羊的重复性优于黄牛的重复性。

表5 TaqMan微流控阵列的重复性检测Table 5 Repeatability test of TLDA

重复性试验结果显示：最高的CV值为2.74%（狗，TLDA3），最低的CV值为0.62%（羊，TLDA1）。22个物种中有2个物种（猪和马）的3个CV值均大于2%，12个物种的3个CV值均小于2%，但没有一个物种的3个CV值均小于1%。即便是检测同一个物种，不同的板间CV值也会存在较大的差异，如检测水牛时，TLDA1、TLDA2和TLDA3的CV值分别为0.67%、2.11%和1.13%，因此，相应的显示其板间重复性的P值为0.031 6，也是唯一一个P值小于0.05的物种，说明检测水牛时其板间的重复性较低；而其他物种的P值皆大于0.05，说明板间差异不大，重复性较好。

2.2 TaqMan微流控阵列特异性验证结果

特异性结果检验显示，TaqMan微流控阵列有较高的特异性，24种（类）物种中，有22个（类）物种的检测既没有出现假阴性也没有出现假阳性，只有2个物种出现了假阴性，整个实验过程没有发现假阳性。特异性的验证往往基于对大量近似物种的检测，如检测黄牛的引物探针的特异性时，往往需要检测水牛、牦牛、山羊、绵羊等同科同属的近似种是否存在假阳性。本研究应用的标准中的引物探针及本研究研发的引物探针，在进行单重荧光定量PCR时已经对该引物探针是否存在假阳性进行了验证。将单重荧光定量PCR整合成微流控阵列后，对某一个引物探针而言产生假阳性的物种一般不会因此增多。但在检测骆驼和鸽时，出现了假阴性，假阴性率分别达到了16.7%和25%。假阴性的出现，可能是由加样操作失误造成的。如在检测骆驼时，在同一列的2个平行样中，出现了假阴性，这很有可能是加样失误造成的；而在鸽的检测时也出现了假阴性，这可能是操作失误引起的，也可能是引物本身灵敏度不太高导致的。如表6所示，检测鸽得到的CT值都在33左右，而实验设定大于35即为阴性。虽然鸽的假阴性和引物灵敏度低有关，但比较单重荧光定量PCR，在同样的DNA检测浓度下，重复3次并没有出现假阴性，说明TaqMan微流控阵列方法较普通单重荧光定量PCR检测的灵敏度低。

表6 TaqMan微流控阵列特异性验证Table 6 Specificity test of TLDA

2.3 TaqMan微流控阵列灵敏度验证结果

KODANI等[21]在使用TaqMan微流控阵列进行呼吸道病毒和细菌检测时，同时与单重荧光定量PCR进行灵敏度比较，发现同样的引物探针序列，在整合到微流控阵列后也存在灵敏度下降的现象。鉴于此，我们在设置灵敏度验证时，选择单重荧光定量PCR的检测低限为最低浓度。检测结果显示：本研究也同样出现了检测灵敏度降低的问题，即和单重荧光定量PCR比较，22个物种中10个物种的检测灵敏度都降低为原来的10%，鸽检测的灵敏度则降低为原来的1%；其他物种成分的检测灵敏度保持不变，检测低限保持为0.1或者0.01 ng/μL（表7）。

3 讨论

本研究将24种（类）检测不同物种的实时荧光定量PCR反应集成在同一张TaqMan阵列中，并对该方法的重复性、特异性及检测灵敏度进行了验证。不论是板内或板间其重复性都比较高，显示板内重复性的22个物种的66个CV值中，11个（占16.7%）CV值低于1%，15个（占22.7%）大于2%，其余（占60.6%）介于1%～2%之间，但没有一个物种的CV值高于3%。显示板间重复性的P值，只有水牛的P值小于0.05，显示板间差异显著，而其他21个物种的板间差异均不显著。

表7 TaqMan微流控阵列与普通单重荧光定量PCR检测灵敏度比较Table 7 Comparison of sensitivity of TLDA and IRTP assays

本研究的特异性验证没有发现假阳性，这可能和混合加样的方式有关。如表3所示，S1列中加入的DNA所包括的物种有黄牛、水牛、骆驼、绵羊、家猪、马、驴，这种将近似种都加入一个混合样中的方法不利于特异性的验证，如“黄牛和水牛、绵羊”“马和驴”都是在种源关系上比较近的物种，若要检测黄牛引物探针的特异性，则该列不应加入黄牛的DNA而应加入水牛、绵羊等其他和黄牛在物种上比较接近的哺乳动物的DNA。马和驴，以及其他禽类和鱼类的特异性引物探针的检测也以此类推，但这样验证需要耗费较多TLDA板。由于本研究所购TLDA板数量有限，故并未实施上述验证。本研究中所选取的引物探针在单重荧光定量PCR中都验证了其特异性，在排列到阵列上后，理论上特异性并不会因此降低。但在实际检测中，TaqMan阵列中出现了单重荧光定量PCR中没有出现的假阴性，假阴性的出现降低了检测的特异性，但这种特异性的降低是灵敏度降低导致的。在比较灵敏度时发现，TaqMan阵列的灵敏度要低于单重荧光定量PCR，22个物种中10个物种的灵敏度降低为原来的10%，1个物种甚至降低为原来的1%，其余11个物种的灵敏度和单重荧光保持一致，但没有灵敏度提高的检测物种。这和KODANI等[21]利用TaqMan微流控阵列进行呼吸道病毒和细菌检测的结果较为一致，都得到了TLDA检测灵敏度较单重荧光定量PCR降低的结果。

判断结果的阴阳性和所设置的CT值的检测低限值密切相关。基于本文中引用的标准，一般RT-PCR普遍进行40个循环反应，因此，本研究中的TaqMan微流控阵列反应以及单重荧光定量PCR的循环数都设置为40个。在40轮反应中，若得到CT≤35，则一般认为阳性比较明显，因此本文中设置CT≤35为阳性，CT＞35为阴性。但本研究的结果显示，单重荧光定量PCR在整合成微流控阵列时，某些检测的灵敏度会降低，鉴于此，可通过适当增加反应循环数，将CT值设置得更高，以此提高灵敏度。如检测低限为0.1和0.01 ng/μL的物种的阈值仍设为35，而检测低限为1或10 ng/μL的物种可根据检测结果将CT值上调。由于本研究购置的微流控阵列的数量有限，没有进一步进行最佳检测限CT值的验证。

此外，本研究发现TaqMan微流控阵列反应对样品DNA的品质要求较高，特别是对DNA的浓度要求较高。如本文中1.5节所提到，要达到在S1列中每个反应孔的目标物种DNA为10 ng，需要将7种检测目标物种的DNA质量浓度均调整为80 ng/μL左右。20 μL的样品加入48个反应孔中，每个孔的样品量不到0.5 μL，因此样品的DNA质量也是试验成功的关键。KODANI等[21]认为，虽然TaqMan微流控阵列方法的灵敏度有所降低，但仍然能满足实际样本检测的需求。本研究也发现，TaqMan微流控阵列对大多数物种的检测灵敏度为0.1 ng/μL，用市售DNA提取试剂盒从鱼、肉等制品中抽提得到的DNA质量浓度一般在10～100 ng/μL之间，即TaqMan方法的灵敏度以质量分数计，为0.1%～1%（0.1/100×100%～0.1/10×100%）。一般应用RTPCR进行物种成分检测鉴定的相关标准中，其检测灵敏度为0.1%。从掺假制假谋取利益的角度考虑，掺假物种成分的含量一般不低于一定的含量，才会有一定的经济利益。因此，即便TaqMan微流控阵列方法的灵敏度为1%，也能满足一般制假掺假的检测要求。虽然该方法具有检测通量高、操作相对简便的特点，但对设备和耗材的要求比较高、检测成本并不低，这也是该方法在食品检测领域应用尚不广泛的原因之一。

4 结论

本研究将TaqMan微流控阵列技术应用到食品真伪鉴别检测中，将不同物种特异性的引物探针集合在同一个TaqMan微流控阵列上，以实现多物种成分同步检测。通过对该方法的重复性、特异性及灵敏度验证，认为该方法可用于食品的真伪鉴别。