沉默Beclin1 基因对β-榄香烯抑制人胃癌SGC-7901 细胞增殖与诱导自噬的影响

陈璐婷 胡梦奕 潘 磊 陈培丰

β-榄香烯由温郁金（温莪术）中提取，具有抗癌作用强、细胞毒性小、抗癌谱广等优点，已广泛应用于临床治疗各种恶性肿瘤及癌性胸腹水。Liu 等[1]研究发现，β-榄香烯能够诱导胃癌细胞发生保护性自噬。Beclin1 基因又称BECN1 基因，是自噬通路中的重要调控因子[2]，研究发现，Beclin1 基因在胃癌呈现高表达[3]。本课题组预实验检测了Beclin1 的mRNA 在SGC-7901、MKN-45、BGC-835 等多个胃癌细胞的表达水平，结果显示在SGC-7901 细胞中表达最高，故选用SGC-7901 细胞为本次实验的靶细胞[5]。本研究探讨β-榄香烯作用SGC-7901 细胞前后细胞增殖和保护性自噬的变化，以及Beclin1 基因对β-榄香烯抗癌作用和诱导自噬的影响。

1 实验材料

1.1 细胞株和慢病毒载体 人胃腺癌细胞株SGC-7901 购自中国科学院上海细胞生物学研究所（批号TCHu 46）。本研究中GV112-NC-shRNA、GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒载体系课题组前期实验构建成功并通过验证，且经实时荧光定量PCR（Real Time PCR）及免疫蛋白印迹（Western blot）筛选出对Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒载体[4]。

1.2 实验药品 β-榄香烯注射液，购自大连华立金港药业有限公司（批号1506221，规格:20mL:0.1g）。分子式:C15H24，相对分子量:204.351，以其为本实验用β-榄香烯母液，浓度为5mg/mL。

1.3 主要试剂及仪器 胎牛血清（澳大利亚Ausbian公司，批号VS500T）；RPMI-1640 培养液（杭州吉诺生物医药技术公司，批号2017070304）；胰酶[（生工生物工程（上海）公司，批号T0458-50G]；Puromycin（美国Clontech 公司，批号631305）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Genview 公司，批号JT343）；二甲基亚砜（DMSO，上海试一化学试剂公司，批号130701）；BCA Protein Assay Kit、RIPA 裂解液（碧云天研究所，批号P0010S、P0013B）；LC3A/B 抗体（美国CST 公司，批号#12741）；GAPDH 抗体（美国Santa Cruz 公司，批号sc-47724）；辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔多克隆IgG 抗体（美国Santa Cruz 公司，批号sc-2004）；倒置显微镜（上海蔡康光学仪器公司，型号XDS-100）；酶标仪（瑞士Tecan 公司，型号M2009PR）；细胞培养箱（日本三洋公司，型号MCO-175）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将人胃癌SGC-7901 细胞置于体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。

2.2 细胞感染 SGC-7901 细胞分为以下三组:空白对照组，未做特殊处理、常规培养的SGC-7901 细胞；阴性对照组，感染非特异性短发夹样RNA（shRNA）慢病毒载体GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 细胞；实验组，感染GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒载体（即前期实验筛选出的对Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒载体） 的SGC-7901 细胞。将SGC-7901 细胞接种于12 孔板中培养，根据预实验所得的最佳感染参数[感染条件:Eni.S+polybrene，感染复数（MOI）:20]，取GV112-Beclin1-shRNA1 和GV112-NC-shRNA 慢病毒颗粒各4μL，分别感染实验组、阴性对照组胃癌细胞，观察细胞状态，未出现细胞毒性反应继续培养并于感染后16h 换液；若出现细胞毒性则立即换液。感染72h 后换用含嘌呤霉素（Puromycin，3μg/mL）的培养基进行药筛处理，至空白对照组细胞全部被杀死后（大约24h），收集存活的细胞并扩增培养建立稳定表达GV112-shRNABeclin1 及阴性对照质粒GV112-shRNA-NC 的细胞模型。

2.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率

2.3.1 剂量依赖实验 收集对数生长期SGC-7901细胞并用胰酶消化处理，完全培养基重悬制成细胞悬液，计数。取96 孔板铺板，细胞密度为10000 细胞数/孔（cell/well），100μL。统一铺好后，放入细胞培养箱内37℃、5%CO2培养24h。分为空白对照组、空白对照加药组（加入β-榄香烯药物浓度分别为10、20、50、100μg/mL），每组设3 个复孔。药物作用细胞24h后，每孔加入20μL 浓度为5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后彻底吸尽培养液，每孔加入150μL DMSO。经振荡器震荡3～5min 后，用酶标仪490nm 检测OD值，计算抑制率。

2.3.2 β-榄香烯联合Beclin1 shRNA 实验 胰酶消化阴性对照组、实验组胃癌细胞并制成细胞悬液，取96 孔板铺板，细胞密度为10000cell/well，100μL。统一铺好后，放入细胞培养箱内37℃、5%CO2培养24h。取上述MTT 实验中最佳浓度的β-榄香烯处理胃癌细胞，实验设置阴性对照不加药组（即阴性对照组SGC-7901 胃癌细胞，不加药）、阴性对照加药组（即阴性对照组SGC-7901 胃癌细胞，加入浓度为100μg/mL 的β-榄香烯药物）；实验不加药组（即实验组SGC-7901 胃癌细胞，不加药）、实验加药组（即实验组SGC-7901 胃癌细胞，加入浓度为100μg/mL的β-榄香烯药物），每组设3 个复孔。加药处理24h后每孔加入20μL 浓度为5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后彻底吸尽培养液，每孔加入150μL DMSO。经振荡器震荡3～5min 后，用酶标仪490nm 检测OD值，计算抑制率。细胞抑制率=（1-OD加药组/OD对照组）×100%。

表1 针对Beclin1 基因的shRNA 和阴性对照shRNA

2.4 Western blot 检测LC3-II、P62 蛋白 收集空白对照组、空白对照加药组、实验加药组、阴性对照加药组的胃癌细胞，提取总蛋白并测定蛋白质浓度。取相同质量的蛋白样品上样SDS-PAGE 凝胶（12%分离胶，5%浓缩胶）电泳分离。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA 恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF 膜上。用封闭液（含5%脱脂牛奶的TBST 溶液）4℃下封闭PVDF 膜过夜，孵育一抗、二抗。PVDF 膜置于平铺好的保鲜膜上，以1:40的比例混合ECL 试剂盒中的A 液和B 液，混合液均匀滴加在PVDF 膜上，避光反应5min。将膜取出，稍稍沥干多余的ECL 底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜，放上X 光片，关上暗盒，曝光1～2min。取出X 光片，放入显影液中，约1min 后取出，在清水中漂洗几min，后放入定影液中至少2min，取出X 光片再次用清水漂洗，晾干。以GAPDH 为内参。

2.5 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件，计量资料采用均数±标准差（） 表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 重组慢病毒质粒的鉴定 前期实验中，课题组根据 Genebank 提供的人 Beclin1 基因信息（NM_003766）设计3 条小干扰RNA（siRNA）序列，同时选用公认阴性对照序列。合成上述序列的短发夹RNA（shRNA），分别命名为Beclin1-shRNA1、Beclin1-shRNA2、Beclin1-shRNA3，NC-shRNA（见表1）。退火反应生成dsDNA，将获得的dsDNA 连接到经Age I、EcoR I 双酶切的GV112 载体，即获得Beclin1-shRNA 慢病毒载体，分别命名为实验1（GV112-Beclin1-shRNA1）、实验2（GV112-Beclin1-shRNA2）、实验3（GV112-Beclin1-shRNA3）、阴性对照（GV112-NC-shRNA）。经阳性克隆的PCR 鉴定及测序分析验证，Beclin1 基因RNAi 慢病毒载体构建成功。

3.2 基因沉默效果鉴定 Real Time PCR 检测慢病毒感染后各组SGC-7901 细胞Beclin1 相对表达量，以阴性对照组（感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 细胞）作为对照，采用2-ΔΔCt 法分析比较，结果显示，相对于阴性对照组，实验1 组（感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 细胞）、实验2 组（感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 细胞）、实验3 组（感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901细胞）的Beclin1 mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.01，见表2）。其中实验1 组Beclin1 基因沉默效率达91.8%，判定实验1 为最有效干扰载体。为进一步确定稳定筛选是否成功，选取最有效干扰载体实验1组和阴性对照组行Western blot 检测，两组样本GAPDH 蛋白表达一致，实验1 组Beclin1 目的条带明显减弱（见图1），证明在蛋白质水平实验1 沉默目的基因有效。

图1 Western blot 鉴定实验1 组Beclin1 蛋白表达

表2 感染重复3 次Beclin1 基因相对表达量（）

表2 感染重复3 次Beclin1 基因相对表达量（）

注:阴性对照组为感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 细胞；实验1组为感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 细胞；实验2 组为感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 细胞；实验3 组为感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901 细胞；与阴性对照组比较，aP＜0.01

3.3 β-榄香烯抑制SGC-7901 细胞增殖作用 不同浓度的β-榄香烯作用人胃癌SGC-7901 细胞，24h后测定OD 值，计算抑制率。结果显示，β-榄香烯能够抑制胃癌细胞增殖，且抑制作用随浓度的增加而递增。浓度20、50、100μg/mL 时的抑制率分别为21.5%、31.7%和37.4%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。浓度为10μg/mL 时抑制率14.0%，与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 MTT 法检测不同浓度β-榄香烯对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响（）

表3 MTT 法检测不同浓度β-榄香烯对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响（）

注:与0μg/mL 比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.4 β-榄香烯诱导SGC-7901 细胞发生自噬作用选用浓度为100μg/mL 的β-榄香烯作用于SGC-7901 细胞，24h 后Western blot 检测LC3-Ⅱ、P62 蛋白表达。与空白对照组比较，经β-榄香烯处理24h后，空白对照加药组的LC3-Ⅱ蛋白表达显著上调，P62 蛋白表达下降（见图2），表明β-榄香烯在抑制胃癌SGC-7901 增殖的同时，也诱导细胞自噬的发生。

图2 Western blot 检测β-榄香烯处理SGC-7901 细胞后LC3-Ⅱ、P62 的蛋白表达

3.5 GV112-Beclin1-shRNA1 感染SGC-7901 细胞慢病毒感染人胃癌SGC-7901 细胞72h 后，加入Puromycin 进行药筛处理，维持药物浓度为3μg/mL，24h 后未感染慢病毒的空白对照组细胞全部死亡，感染重组慢病毒后的细胞存活且状态良好（见图3）。

图3 倒置显微镜下，嘌呤霉素筛选后人胃癌SGC-7901 细胞的存活情况（×100 明亮视野）

3.6 沉默Beclin1 基因对β-榄香烯诱导自噬及抗癌效果的影响 GV112-Beclin1-shRNA1、GV112-NCshRNA 慢病毒颗粒感染SGC-7901 细胞后，Western blot 检测发现，与阴性对照组比较，实验组LC3-Ⅱ蛋白表达下降，P62 蛋白表达升高（见图4），表明沉默Beclin1 基因可抑制胃癌细胞的自噬活性。加入浓度为100μg/mL 的β-榄香烯，24h 后采用Western blot 检测自噬相关蛋白。与阴性对照加药组比较，实验加药组的LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显下降，P62 蛋白表达增加（见图4），表明自噬作用受到抑制。MTT 结果显示，实验加药组细胞抑制率42.3%，阴性对照加药组的细胞抑制率为36.1%，实验加药组对胃癌细胞的抑制效果强于阴性对照加药组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

图4 沉默Beclin1 基因对细胞自噬及β-榄香烯自噬诱导作用的影响

表4 MTT 法检测沉默Beclin1 基因对β-榄香烯抑制胃癌增殖的影响

4 讨论

榄香烯注射液，由姜科植物温郁金（温莪术）中提取，以β-榄香烯为主要成分。本研究显示，β-榄香烯对人胃癌SGC-7901 细胞有明显的抑制增殖的作用，且该作用随着β-榄香烯浓度的升高而增强，呈现剂量依赖性。自噬（Autophagy）被称为Ⅱ型程序性死亡，是细胞降解并回收利用长寿蛋白质及细胞器等成分而维持细胞稳态的分解代谢过程，与包括肿瘤在内的多种疾病有密切的关联[5-6]。LC3 是自噬的标志性因子，自噬发生时，LC3-I 酯化形成LC3-II 并定位于自噬体的膜上，LC3-II 的高低可反映自噬水平[6]。P62 是评价自噬体降解的重要指标，当自噬被激活时，P62 会与泛素化的蛋白质及自噬体膜上的LC3-Ⅱ结合形成复合物，在自噬溶酶体内完成降解过程[7]，P62 的表达水平与自噬活化程度呈负相关。本研究选用100μg/mL 的β-榄香烯作用于SGC-7901细胞，观察到LC3-Ⅱ蛋白明显增加，P62 蛋白明显下降，提示β-榄香烯诱导SGC-7901 细胞发生了自噬，通过慢病毒颗粒感染SGC-7901 细胞后，加入β-榄香烯后细胞自噬活性较前增强，从而再次证明榄香烯诱导细胞自噬发生。

研究显示，自噬在肿瘤细胞中具有抑制和保护的双重作用，自噬与恶性肿瘤的关系可以根据肿瘤微环境、肿瘤类型和其他因素的变化而变化。有学者提出，在肿瘤早期，细胞自噬可以通过消除突变或受损的蛋白质和细胞器等成分以维持细胞内稳态、抑制肿瘤发展；在进展期，当肿瘤细胞处于营养匮乏、缺氧及抗肿瘤治疗等应激环境时，升高的自噬活性通过介导细胞内能量和代谢产物循环利用，协助癌细胞逃避损害，维持肿瘤的生长，即保护性自噬[8]。亦有研究表明，药物诱导的自噬既可以是自噬性细胞死亡，也可以是保护性自噬拮抗其抗肿瘤活性[9]。

自噬的发生受到多种分子机制的调控影响，其中Beclin1 基因起到重要作用[10]。Beclin1 是自噬过程的正向调控基因[11]，通过与PI3K3 结合形成复合物，参与吞噬泡的聚集与组装，诱导细胞自噬[12]。研究证实，上调Beclin1 在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生，而沉默Beclin1 基因则会引起自噬水平的降低[13-14]。本研究发现，沉默Beclin1 基因可下调SGC-7901 细胞的自噬活性，并可抑制β-榄香烯对SGC-7901 细胞自噬的诱导作用，但增强β-榄香烯对SGC-7901 细胞增殖的抑制作用。由此认为，β-榄香烯诱导SGC-7901 细胞发生保护性自噬，这与Liu等[1]研究结果一致，沉默Beclin1 基因的表达能够增强β-榄香烯的抗癌作用。

综上所述，β-榄香烯能够剂量依赖性的抑制胃癌细胞增殖，在抑制增殖的同时也诱导胃癌细胞发生保护性自噬，Beclin1 基因或为其诱导保护性自噬的靶点。沉默Beclin1 基因能够抑制保护性自噬的发生，并且提高β-榄香烯的抗肿瘤增殖作用。