GP73预测慢性乙型肝炎患者肝硬化进展研究

刘沁雨，常 越，张 文，张 青，卢诚震，李 海

目前，全球约有3亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，我国慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者人口基数较大，平均死亡年龄约为59.8岁。死亡原因主要是终末期肝脏疾病，如失代偿期肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等[1]。有研究报道，20%～30%的HBV患者可进展至肝硬化，在中国超过84%的肝细胞癌是由HBV引起的[2]。但现有抗病毒治疗对于绝大多数患者较难达到理想治愈，仅能够延缓疾病进程，无法完全避免终末期肝脏疾病的发生。目前，除肝脏活组织检查这一有创检测手段诊断肝脏疾病进程外，血清无创检测也越来越受到医务工作者的关注，GPR无创诊断模型是近年来新发现的一种诊断肝硬化的模型[3]。但研究表明，相比血清模型，血清中特异蛋白的诊断对肝脏疾病进程可能更加敏感,如血清高尔基体蛋白73(golgi protein 73，GP73)是近年来用于肝细胞癌诊断的新指标，后期研究发现其与肝硬化的发展也存在良好相关性[4，5]。因此，本研究重点分析血清GP73在抗病毒治疗慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎肝硬化患者中的表达差异，探讨血清GP73浓度对慢性乙型肝炎肝硬化患者的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年1-12月在武警特色医学中心肝胆胰脾科就诊已进行长期抗病毒治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者。经初筛实验队列纳入188例，排除81例，最终入组107例，其中男性72例，女性35例，年龄(52±11.55)岁。根据《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》同时参考临床表现、影像学、实验室检查等综合考虑，将入组患者分为慢性乙肝组(59例)和慢性乙肝肝硬化组(48例)。纳入标准：(1)血清HBsAg阳性超过6个月；(2)肝硬化诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中相关诊断标准；(3)均进行抗病毒治疗，疗程超过2年；(4)无恶性肿瘤病史；(5)年龄在18～75岁。排除标准：(1)伴有其他慢性肝病，如非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、其他病毒性肝炎等；(2)伴有心脑肾重要脏器疾病者；(3)妊娠或哺乳期妇女；(4)伴有血液疾病，如严重贫血等；(5)血液样本出现溶血等不良情况。

另选取2018年8-11月就诊于天津市第二人民医院肝病科的慢性乙型肝炎患者。经初筛验证队列纳入158例，排除25例，最终入组133例，其中男性95例，女性38例，年龄(56.83±10.79)岁。采取相同方法将入组患者分为慢性乙肝组(97例)和慢性乙肝肝硬化组(36例)。纳入排除标准同上。所有患者及家属了解研究内容并签署知情同意书，该研究获伦理委员会批准(临科2016-0041.2)。

1.2 方法

1.2.1 基本资料 收集患者人口学资料，包括年龄、性别；实验室资料，包括总胆红素(total bilirubin,TBil)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰转移酶(glutamyltransferase,GGT)、血小板计数(platelet count,PLT)。生化分析采用西门子全自动样品处理系统测定，PLT采用希森美康xs-1000i的血液细胞分析仪测定。

1.2.2 GPR 无创血清学诊断模型计算公式:GPR=(GGT/ULN)×100/PLT(109/L)[3]。

1.2.3 血清GP73 含量测定收集患者当日1 ml血清样本并冻存于-80 ℃冰箱。血清GP73浓度测定采用标准酶联免疫吸附实验(ELISA)法，实验流程按照试剂盒(海南众森生物科技有限公司)提供的说明书严密进行。所有血清样本统一于2019年1月及3月分别进行测定，所有测定指标均重复3次，无异常波动结果被认为是准确的。

1.2.4 测定肝硬度值 入组患者肝硬度(liver stiffness measurement,LSM)值测定由本院具有10年操作经验的同一彩超医师完成。患者取仰卧位，右臂高举过头，使肝区肋间隙充分暴露，选择右侧第7、8、9肋间，将涂有耦合剂的换能探头紧贴肋间隙选取适当时机测定LSM值。最后检测结果需至少成功测定10次并取中位数，同时还需满足四分位间距 (interquartile range，IQR)小于中位数的30%和成功率大于65%的要求[6]。

2 结 果

2.1 试剂盒产品性能分析 经多次实验测量计算得出本试剂盒标准曲线相关系数r均>0.99，线性关系良好，批内重复性变异系数≤15%，批间重复性变异系数≤15%，即本试剂盒可靠。

2.2 两组队列患者基本资料比较 分析将可能影响乙肝肝硬化发生的基本资料进行分析，实验队列结果显示：乙肝肝硬化组年龄、TBil、ALP、PLT、LSM、GPR、GP73数值明显高于乙肝组，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)。其余指标差异均无统计学意义(表1)。

验证队列结果显示：乙肝肝硬化组年龄、TBil、AST、ALP、GGT、PLT、LSM、GPR、GP73数值明显高于慢性乙肝组，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)。其余指标差异均无统计学意义(表1)。

将实验队列与验证队列基本资料进行比较，发现两组队列为病情有所差别的非同质队列，但其临床诊断准确(表1)。

表1 慢性乙肝肝硬化两队列患者主要特点比较 (n；%)

2.3 血清GP73含量与肝脏炎症程度及发生肝硬化的相关性 对实验队列两组患者血清GP73浓度与ALT、AST、TBil进行Pearson相关性分析，发现GP73浓度与其具有相关性(ALT：r=0.244，P=0.012；AST：r=0.373，P=0.000；TBil：r=0.451，P=0.000)，将两组患者血清GP73浓度与是否发生肝硬化进行Spearman相关性分析发现两者具有相关性(r=0.846，P=0.000)。对验证队列做相同分析发现此队列中GP73浓度与ALT、AST、TBil浓度具有相关性(ALT：r=0.226，P=0.010；AST：r=0.505，P=0.000；TBil：r=0.532，P=0.000)，与发生肝硬化同样具有相关性(r=0.591，P=0.000，图1)。

图1 两队列慢性乙肝组和慢性乙肝肝硬化组GP73浓度与ALT、AST、TBil浓度的Pearson相关性分析

2.4 血清GP73含量对肝硬化的诊断价值 通过将两组队列的GP73、GPR、LSM值尝试构建乙肝肝硬化诊断的ROC曲线，实验队列结果显示：各指标诊断乙肝肝硬化的曲线下面积分别为LSM(AUC1=0.844)、GPR(AUC1=0.922)、GP73(AUC1=0.991)。各项指标相比，GP73AUC最高，其最佳诊断点为3.65 μg/L，特异性为100%，敏感性达93.2%。

验证队列结果显示：LSM(AUC2=0.730)、GPR(AUC2=0.724)、GP73(AUC2=0.870)。GP73AUC最高，其最佳诊断点为3.67μg/L，特异性为83.3%，敏感性达87.6%。对比几种检测方法正确率可发现两组结果均显示GP73对诊断乙肝肝硬化正确率明显高于其余两种方法(图2)。

3 讨 论

目前，全球CHB患病率呈逐年下降趋势，但由于前期患病人口基数较大，我国仍有9300万HBV感染者[7，8]。临床上常用的检测肝脏疾病进展手段包括有创和无创检测，但上述检测方法都存在一定的局限性[9]。为弥补这一局限性，Lemoine等[10，11]构建了GPR模型。后续研究表明，GPR模型优于指南推荐的APRI等无创血清学模型。Kladney等[12]研究巨细胞性肝炎时发现了GP73。正常肝组织中GP73在肝细胞内几乎不表达，但学者研究发现肝癌患者的肝细胞中GP73表达上调，这项研究发现使GP73成为预测肝癌发生的新兴无创指标。后续对良性肝脏疾病进一步研究发现，患者肝细胞和血清中也可出现高表达的GP73，且其浓度随肝脏疾病严重程度上升[13]。因此，GP73和肝脏疾病的相关性引起了国内外学者的关注。本研究通过对血清GP73浓度分析，研究其对于诊断CHB及其相关肝硬化是否具有可行性。

本研究通过对CHB和CHB肝硬化患者比较发现，两队列中年龄、肝脏炎症程度指标、总胆红素存在明显差异。这表明随着年龄增长，病毒侵犯时间延长，肝脏炎症程度加重，肝纤维化逆转率降低，使得老年患者更易进展至肝硬化。同时发现两组队列肝硬化患者GPR(P1=0.000，P2=0.000)、LSM(P1=0.000，P2=0.000)、GP73(P1=0.000，P2=0.026)都明显高于CHB患者。LSM是目前运用最为广泛的无创影像学诊断指标，同时也是指南中推荐的无创诊断方法之一，但其易受患者总胆红素、体型等外界因素影响。GPR模型是近年来新提出的血清无创诊断模型，其主要由GGT和PLT比值进行判断，黄春明等[14，15]的研究和本研究两组队列的GPR都反映出CHB和肝硬化患者之间具有统计学意义。本研究选取两家医院的研究结果，虽患者病情有所差异，但经研究表明GP73在诊断CHB肝硬化的方面具有一定可行性。肝硬化患者GP73浓度与肝脏受损程度密切相关，笔者认为相较于CHB患者，肝硬化患者肝脏受到炎症因子的侵袭更为严重，肝细胞受损更为明显，在肝细胞受损的同时其释放了大量GP73进入血清，导致肝硬化患者血清中GP73浓度高于CHB患者[16，17]。同样乐萍等[18]研究也发现，在肝硬化患者中血清GP73浓度较CHB患者明显升高。

图2 不同血清无创诊断对慢性乙型病毒性肝炎肝硬化的诊断价值

AB图为GPR、LSM、GP73对诊断慢性乙型病毒性肝炎肝硬化的ROC曲线，CD图为采用三种诊断方法后每种方法对诊断慢性乙型病毒性肝炎和肝硬化的准确率

临床上ALT、AST都是反映肝损害的重要血清学指标，研究表明转氨酶随肝脏疾病严重程度而升高[1,19]。虽然本研究显示两组队列中患者ALT并无明显差异，经分析可能与肝硬化患者长期服用抗病毒药物，进而促使患者肝炎程度差异不明显有关。本研究通过将两组队列中的血清GP73与转氨酶、总胆红素、是否发生肝硬化进行相关性分析发现，血清GP73与其均具有相关性，其中与是否发生肝硬化密切相关(r1=0.846，P1=0.000；r2=0.591，P2=0.000)，Cao等[20]的研究也有类似结果。血清GP73能反映肝脏炎症程度和肝细胞受损程度。虽然目前血清GP73在乙肝肝硬化疾病中的作用机理尚不清楚，但研究表明高表达的GP73可促使细胞增殖和肝细胞再生，同时研究发现GP73可在肝星状细胞中表达，加速肝纤维化进程，相比转氨酶等肝脏炎性反应程度指标，GP73浓度可随肝纤维化分期而升高。因此基于文献[21-24]研究和本研究发现笔者认为GP73可以作为反映肝脏纤维化严重程度的一个参考指标。

ROC曲线可以较全面高效的评判诊断指标，因此本研究将GPR模型、血清GP73、LSM值诊断肝硬化的可行性进行了ROC曲线的绘制。结果表明三种无创检测手段对诊断肝硬化都具有较高的诊断价值，GP73在实验队列中当血清浓度达3.65 μg/L(AUC1=0.991)、验证队列达3.67 μg/L(AUC2=0.870)时，对鉴别CHB患者是否进展至肝硬化具有较高的特异性和敏感度(特异度1=100%，敏感性1=93.2%；特异度2=83.3%，敏感性2=87.6%)。同时我们发现GPR模型(AUC1=0.922，AUC2=0.724)、传统FibroScan诊断即LSM值(AUC2=0.844，AUC2=0.730)对诊断肝硬化相较于GP73这一新型无创检测手段其准确性有所下降。通过对三种无创指标诊断正确率计算分析发现，不论对CHB还是肝硬化患者GP73检测的正确率最高，由此笔者认为血清GP73具有诊断CHB肝硬化的应用条件，在临床上可能给医生提供了又一个较好监测指标。

本研究虽收集了两家中心医院的样本，但最终入组患者样本较少，同时需要指出的是本研究入选患者因进行了抗病毒治疗导致大多患者转氨酶小于2倍正常值，但通过个别数据笔者研究发现转氨酶过高可能会影响研究结果，因此GP73在转氨酶大于2倍正常值患者中对肝硬化诊断的准确性有待后续进一步研究。肝脏病理活检是判断肝硬化的金标准，但因患者意愿、经济能力等原因未能对入组患者全部进行肝脏病理活检。

综上所述，血清中GP73的浓度与乙肝肝脏疾病严重程度密切相关。当其浓度达到3.65 μg/L左右时，提示患者有进展至肝硬化的可能。临床医生应密切观察患者病情进展，提前干预，降低患者进展至终末期肝脏疾病的可能性。GP73浓度通常可以采用ELISA试剂盒进行检测，操作方便、性价比较高，受用范围较广，特别是对于医疗条件欠发达地区，GP73检测是一高性价比的检测诊断手段。