响应面法优化提取南方红豆杉黄酮的工艺研究*

王昱霁 朱婉萍

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

本研究利用微波辅助法，提取南方红豆杉枝叶中的黄酮类化合物，在单因素试验的基础上采用响应面法优化提取工艺，以期获得较高的提取得率。为后续研究南方红豆杉中的黄酮类化合物或其他有效成分，为提高南方红豆杉资源的综合利用率提供实验基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器：南方红豆杉枝叶（宁波泰康红豆杉生物工程有限公司提供），清洗晒干粉碎并过50目筛；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院）；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂，均为分析纯级。MAS-II PLUS微波萃取工作站（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UV1800型可见紫外分光光度计（岛津）；MS204分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 芦丁标准曲线的绘制：采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[1]绘制标准曲线。称取在105℃下干燥至质量恒定的10mg芦丁标准品，置于25ml容量瓶中，用65%乙醇溶液溶解并定容，配制成浓度为0.4mg/ml的芦丁标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置于10ml容量瓶中，各加65%乙醇至5ml，依次加入 5%NaNO2溶液 0.3ml，摇匀，放置 6min；加 10%Al(NO3)3溶液0.3ml，摇匀，放置6min；加入4%NaOH溶液4ml，摇匀，放置15min，再定容至10ml。以不加芦丁对照品溶液同法操作得到的溶液作为空白对照，全波段扫描，找到吸收度最大波长，在最大波长处测定吸收度。

1.3 南方红豆杉总黄酮的提取和吸光度测定：称取粉碎并过50目筛的南方红豆杉粉末5g，装入四颈瓶，加入不同浓度的乙醇溶液为溶剂，在不同提取条件下，利用微波萃取工作站进行微波辅助提取，提取后离心（2500 r/min，10min），取上清，补足加入溶剂的量后，得到南方红豆杉总黄酮待测液。将提取所得的每份样液，分别取0.5ml，按“1.2”方法测定吸光度，根据标准曲线和加入的提取溶剂体积计算南方红豆杉总黄酮提取得率。

1.4 单因素实验设计：以南方红豆杉总黄酮提取得率为指标，在固定其他实验条件的情况下，分别考察乙醇浓度、微波时间、微波功率、提取温度和料液比对南方红豆杉黄酮提取得率的影响。用紫外分光光度计测定提取液中的总黄酮含量，根据南方红豆杉总黄酮的提取得率，考察分析微波萃取中单个因素的影响。

1.4.1 乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响：按“1.3”操作方法，固定条件：微波时间10min，微波功率450W，提取温度60℃，液料比30ml/g，分别考察乙醇浓度为55%、60%、65%、70%、75%对总黄酮提取得率的影响。

1.4.2 微波时间对总黄酮提取得率的影响：按“1.3”操作方法，固定条件：乙醇浓度60%，微波功率450W，提取温度60℃，液料比30ml/g，分别考察微波时间为5、10、15、20、25、30min对总黄酮提取得率的影响。

1.4.3 微波功率对总黄酮提取得率的影响：按“1.3”操作方法，固定条件：乙醇浓度60%，微波时间10min，提取温度60℃，液料比30ml/g，分别考察微波功率为250、350、450、550、650、750W对总黄酮提取得率的影响。

1.4.4 提取温度对总黄酮提取得率的影响：按“1.3”操作方法，固定条件：乙醇浓度60%，微波时间10min，微波功率450W，液料比30ml/g，分别考察提取温度为40、50、60、65、70、75、80℃对总黄酮提取得率的影响。

1.4.5 液料比对总黄酮提取得率的影响：按“1.3”操作方法，固定条件：乙醇浓度60%，微波时间10min，微波功率450W，提取温度60℃，分别考察料液比为10、20、30、40、50ml/g对总黄酮提取得率的影响。

1.5 响应面法优化南方红豆杉总黄酮提取的实验设计：在单因素实验的基础上，选择微波时间、提取温度和料液比为自变量，运用Design Expert 6.0.1软件按照Box-Behnken设计方法进行3因素3水平的响应曲面法分析，并对数据进行多项式回归分析，建立二次响应回归模型，拟合二次回归方程，得到微波辅助提取总黄酮的最佳工艺参数。实验设计方案见表1。

1.6 数据处理：根据单因素实验结果分析作图；响应面优化实验的数据用Design-expert 6.0.1软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线：全波段扫描得出的最大吸收波长为：508nm；以吸收度(A)为纵坐标，溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。芦丁标准溶液中芦丁的质量与吸光度拟合的回归方程为：吸光度A=11.985C+0.0277，R2=0.9997。结果表明，芦丁在质量为0.0206～0.206mg时与其吸光度线性关系良好。

2.2 单因素实验结果分析：分述如下。

2.2.1 乙醇浓度对红豆杉总黄酮提取得率的影响：随着乙醇浓度的升高，总黄酮的提取得率先增加后降低，当提取溶剂为65%乙醇时，总黄酮得率最高，表明65%乙醇溶液的极性最适合提取南方红豆杉中的黄酮类成分。

2.2.2 微波时间对红豆杉总黄酮提取得率的影响：在微波时间5～20min间，随着微波时间的延长总黄酮的提取得率增大；在20min后，提取得率迅速下降。原因可能是当微波时间过长时，会造成黄酮结构的破坏或者是其活性成分的损失因而造成总黄酮得率的下降，因此最佳的微波时间为20min。

2.2.3 微波功率对红豆杉总黄酮提取得率的影响：随着微波功率的升高，总黄酮的提取得率呈现先增大后减小的趋势，当微波功率为550W时总黄酮的提取得率最高。

2.2.4 提取温度对红豆杉总黄酮提取得率的影响：在提取温度40～60℃之间，随着温度的升高，总黄酮的提取得率增大；在60～80℃之间，总黄酮的提取得率迅速下降。因此，提取温度为60℃总黄酮的提取效果最好。

2.2.5 液料比对红豆杉总黄酮提取得率的影响：随着液料比的增大，总黄酮的提取得率呈现先增大后减小的趋势。说明液料比在10～30ml/g范围内，溶液体积越大，总黄酮溶解的越多。但是当溶剂含量过大时，溶剂对微波的能量吸收增加，导致细胞液对微波能量的吸收减少，造成细胞破壁不完全，黄酮类物质不能充分溶出，从而使其含量出现下降趋势。因此，液料比为30ml/g时总黄酮的提取得率最高。

2.3 响应面法优化实验结果：具体如下。

2.3.1 建立模型：在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken组合设计原理，以总黄酮提取得率为响应值（Y），利用Design Expert 6.0.1软件设计了3因素3水平的响应面实验，对总黄酮的提取条件进行优化，共进行17个实验点，其中包含12个析因点和5个零点实验，12个析因点实验用以考察微波时间、提取温度、料液比3个因素对微波提取总黄酮含量的影响是否显著，5次零点实验用作误差估计。实验设计和结果见表2。

2.3.2 方差分析与显著性检验：利用Design Expert 6.0.1软件对实验结果进行二次多项式回归拟合，对表3的数据进行方差分析后，得到模型的二次多项式回归方程如下：

Y=4.58+0.070A-0.035B+0.062C-0.006325AB-0.00965AC-0.066BC-0.15A2-0.12B2-0.061C2。

由表3回归方差分析结果可以看出，模型的失拟项不显著，P=0.0886＞0.05，响应面的回归模型极显著，P＜0.01，回归方程R2=0.9661＞0.9，说明该模型对本实验拟合较好[2]，能较好地描述各因素与响应值之间的关系，所以，可以利用此回归方程确定南方红豆杉枝叶中总黄酮的最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%，超声波功率550W，提取温度60.29℃，提取时间20.60min，液料比31.59ml/g；在此条件下提取的总黄酮得率为4.59806%。

从表3还可以看出回归模型中因素A、C的P＜0.01，表明微波时间、提取温度对东北红豆杉枝叶总黄酮得率影响极显著，而因素B的影响显著（P＜0.05），且影响总黄酮得率的因素主次为微波时间(A)＞提取温度(C)＞液料比(B)；而因素交互项BC影响极显著，二次项A2、B2影响极显著，C2影响显著，说明各因素对红豆杉枝叶总黄酮得率不是简单的线性关系，存在着交互影响；交互项AB、AC对实验结果的影响不显著（P＞0.05），即微波时间与提取温度、微波时间与液料比之间交互作用不显著。

表3 方差分析与显著性检验

2.3.3 响应面分析与优化：根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图，分析微波时间、提取温度和料液比等因素及其交互作用对微波辅助提取总黄酮得率的影响。结果见图1～图3。

图1 总黄酮提取得率=f（A，B）响应曲面图（C=35ml/g）

图2 总黄酮提取得率=f（A，C）响应曲面图（B=60℃）

图3 总黄酮提取得率=f（B，C）响应曲面图及等高线图（A=20min）

通过响应面的坡度陡峭程度和等高线图椭圆形状可以直观反映出两个因素交互作用的强弱程度。由图1～图3可知，微波时间与提取温度、微波时间与液料比的交互作用不显著，与上述方差分析和显著性检验相符。

2.3.4 验证实验：为了验证回归模型预测的试验结果是否与真实情况相一致，结合考虑响应面优化所得的最佳工艺条件和实际操作的可行性，选择工艺条件：乙醇体积分数60%，超声波功率550W，微波时间21min，提取温度60℃，液料比32ml/g。对得到的最佳工艺条件进行3次验证性实验，分别得到南方红豆杉枝叶总黄酮得率实际值4.5951%、4.6036%、4.5833%，平均值4.5940%，验证实验结果与响应面软件分析得出的理论值接近，且测定结果稳定，重复性好，说明响应面优化结果可靠。

3 结论

近年来研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化等作用[3]。目前，对红豆杉中黄酮类化合物提取工艺优化的报道较少。本文以南方红豆杉枝叶为原料，采用微波辅助提取南方红豆杉总黄酮，在单因素实验结果基础上以总黄酮提取得率为评价指标，通过响应曲面法分析对提取工艺参数进行优化，得到最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数60%，超声波功率550W，微波时间21min，提取温度60℃，液料比32ml/g。在此条件下提取1次的总黄酮得率为4.5940%。使用响应面优化微波辅助法提取南方红豆杉黄酮的结果准确可靠，工艺稳定可行，可为后续研究南方红豆杉各种有效成分提供实验基础；为开辟南方红豆杉新用途、扩大其药用范围提供参考依据。