镉暴露对蛋鸡钙沉积的影响

李 浪，张 娟 ，刘光芒，王建萍，林 燕，白世平，张克英，张军民，赵青余，吴彩梅*

（1.四川农业大学动物营养研究所/农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室，成都 611130；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

镉（Cd）是一种常见的重金属污染物，是人与动物的非必需重金属元素。镉通过饲粮、饮水、空气等途径被动物吸收进而蓄积于体内各个组织中，从而对各组织器官造成不同程度的损伤，严重影响动物及人体的正常生理功能[1-2]。钙代谢紊乱是镉毒性的重要方面，而镉对蛋鸡钙代谢影响及对鸡蛋和蛋壳质量影响研究较少，因此，开展本研究为镉对蛋鸡钙代谢和钙沉积的影响及对鸡蛋蛋壳质量的影响提供基础数据，同时为镉影响蛋鸡钙代谢的机理研究奠定基础。镉作用于肠道和肾脏，可导致肠道对钙的吸收减少、肾脏对钙的排泄增加，使机体处于负钙平衡，作用于骨骼引起骨骼矿化障碍、骨钙溶出增加，临床表现为骨软化、骨质疏松[3-6]。M.NISHIJO等[7]研究了不同地区、不同年龄段成年男性和女性长时间暴露在低镉环境中的血液镉，尿镉和骨损伤之间的关系，结果显示镉暴露尤其是血镉会影响骨骼重塑，而M.H.Bhattacharyya等[8]证明镉暴露使雌鼠椎体骨密度峰值降低，尿钙排泄增加，钙排泄分数增大，降低细胞内钙的积累和钙化结节的形成。在鹌鹑日粮中添加不同剂量的镉会使鹌鹑的产蛋率、蛋重、蛋壳强度降低[9]。在蛋鸡饲粮中添加镉会降低蛋鸡生产性能、产蛋率，使蛋壳变薄、软壳蛋数增多[10]。镉暴露引起的人类和动物的钙代谢失衡，如尿钙增多、骨质减少、骨质疏松症、骨软化症等已被广泛报道[2，4，8，11-12]，而钙是鸡蛋中的营养物质，且是蛋壳的主要组成成分，镉影响蛋鸡钙吸收会直接影响蛋品质和蛋鸡健康。因此，本试验拟通过在蛋鸡玉米-豆粕型基础饲粮中添加不同剂量的镉（CdCl2形式），测定蛋鸡血液、胫骨、粪尿、蛋黄、蛋清及蛋壳中镉钙含量、蛋壳品质及胫骨强度，明确饲粮镉暴露对产蛋高峰期蛋鸡钙代谢和蛋品质的影响，对明确镉对蛋鸡健康和蛋品质的毒性作用及为镉影响蛋鸡钙代谢的机理研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物

本实验动物选用150只处于产蛋高峰期（40周龄）的健康的粉壳罗曼蛋鸡。

1.2 试验设备及试剂

1.2.1 试验设备

ContrAA 700高分辨率连续光源原子吸收光谱仪（配有MPE60自动进样器），（德国Analytik Jena公司）；CEM-MARS6型智能微波消解仪（美国CEM公司）；BHW-09Y型智能赶酸仪（上海博通化学科技有限公司）；MILLIPORE实验室超纯水系统（美国密理博公司）；TA-XT plus型物性测定仪（英国SMS公司）；CP-224s型万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；EMT-5200型蛋品质分析仪（日本TOUHOKURHYTHM公司）；移液器（德国Eppendorf公司）；玻璃器皿均用体积分数为5%的硝酸溶液浸泡24 h以上。

1.2.2 试验试剂

镉、钙标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；浓硝酸HNO3（四川西陇化工有限公司）；盐酸（四川西陇化工有限公司）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司）；过氧化氢H2O2；实验所用试剂均为优级纯（GR）；实验用水为18.2 MΩ·cm的超纯水。

1.3 试验设计

将40周龄150只处于产蛋高峰期的健康粉壳罗曼蛋鸡随机分为5个处理组，每个处理3个重复，每个重复10只鸡。处理组1为对照组，饲喂玉米-豆粕型基础饲粮（参照NRC1994标准配制），饲粮组成和营养水平见表1。处理组2～5为试验组，饲喂在基础饲粮中分别添加 10、30、50、70 mg/kg镉（CdCl2）的试验饲粮，试验方案见表2。试验前期，预饲1周，试验期8周，试验期内，蛋鸡自由采食和饮水，试验末期，收集鸡蛋，每个重复选取三只鸡，屠宰。

表1 基础饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis)%

表2 实验设计方案Table 2 Experimental design

1.4 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养所试验场进行?采用三层全阶梯笼养，自然光照与人工照明相结合，保证每天16 h光照，舍内温度控制在25℃左右，鸡舍内采用机械通风和自然通风进行通风和换气，试验全期自由饮水，每日饲喂 2 次（09:00；13:00），并观察鸡有无异常行为。定期打扫圈舍卫生，按常规方法进行饲养管理及免疫。

1.5 样品采集

第八周末试验结束后，从每个重复中随机选取3只鸡（每个处理组9只，共45只），禁食12小时后采用肝素钠抗凝管翅静脉采血3 000 r/min离心10 min分离血浆，断头法处死，取其胫骨、粪尿样品冷冻保存。收集第8周末的鸡蛋，从每个重复组中随机选取5枚鸡蛋分离蛋清和蛋黄，将5个鸡蛋的蛋清和蛋黄分别混匀，混匀后从中取出50克左右冷冻保存。5枚蛋壳用棉签清理蛋清后称重，冷冻保存。

1.6 指标测定与方法

1.6.1 测定指标

测定血浆、胫骨、粪便、蛋清、蛋黄、蛋壳中的Cd、Ca含量、蛋壳质量以及胫骨强度。

1.6.2 指标测定方法

血浆、粪便、胫骨、蛋清、蛋黄、蛋壳中镉和钙测定采用原子吸收光谱法[13]，胫骨、蛋壳中钙含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[14]中高锰酸钾滴定法测定。胫骨强度：采用物性测定仪测定。

蛋壳品质：蛋壳重、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳比率均采用蛋品质分析仪测定。

1.7 数据统计

所有实验数据采用Excel 2007整理，采用SAS 9.4中One-way ANOVA进行单因素方差分析和显著性检验，结果用平均值±标准差表示，当P＜0.05时为差异显著，P＜0.01时为差异极显著。再根据Linear或Quadra是否显著，显著者用SAS进行一元多阶回归分析，线性表示为Y=a+bX，其中a表示截距，b表示直线的斜率，R2表示决定系数，二次表示为Y=aX2+bX+c，其中a表示二项系数，决定抛物线开口方向，b表示一项系数，和a共同决定对称轴位置，c为常数项。

2 结果与分析

2.1 饲粮镉对蛋鸡粪尿、胫骨、血浆、蛋清、蛋黄、蛋壳中镉残留量的影响

粪尿、胫骨、血浆、蛋清、蛋黄中镉含量结果见表3。粪尿中镉残留量为mg/kg级，随饲粮镉添加量的增加呈一次线性增加（y=0.624 7+0.009 7x，R2=0.903 9，P＜0.000 1），各处理组粪尿中镉残留量极显著高于对照（0 mg/kg）组，除50 mg/kg组和70 mg/kg组外，其余各处理组间均差异极显著（P＜0.01）；胫骨中镉残留量为mg/kg级，随饲粮镉添加量的增加呈一次线性增加（y=0.091 1+0.018 3x，R2=0.726 7，P＜0.000 1），对照组（0 mg/kg）、10 mg/kg 组和 30、50、70 mg/kg组差异显著（P＜0.05）。血浆中镉残留量为μg/L级别，随饲粮镉添加量的增加呈一次线性增加（y=1.232 5+0.023 2x，R2=0.772 4，P＜0.000 1），各处理组与对照组（0 mg/kg）相比差异极显著（P＜0.01）；蛋黄蛋清镉残留量为μg/kg级，蛋黄镉残留量高于蛋清，随饲粮镉添加量的增加呈一次线性增加（y=2.599+0.405 7x，R2=0.920 7，P＜0.000 1）；30、50、70 mg/kg 组的蛋黄镉残留量极显著高于对照组（0 mg/kg）和10 mg/kg组（P＜0.01），10 mg/kg组和对照组（0 mg/kg）间差异不显著（P＞0.05）；蛋清中的镉残留量各处理组间差异均不显著（P＞0.05），蛋壳中镉含量过低未检出（课题组前期建立的石墨炉快速测定镉含量的方法中镉的检出限为0.244 ng/mL）。

2.2 饲粮镉对蛋鸡粪尿、胫骨、血浆、蛋壳中钙含量的影响

粪尿、胫骨、血浆、蛋清、蛋黄中钙含量结果见表4。由表4可知，血浆中钙含量变化无明显趋势（P＞0.05）；粪尿中钙含量随饲粮中镉添加量的增大而增大，呈一次线性增加（y=19.7269+1.3221x，R2=0.8505，P＜0.000 1），30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 组镉含量极显著高于对照组（0 mg/kg）和 10 mg/kg组（P＜0.01）；胫骨中钙含量随饲粮中镉添加量增加呈一次线性减少（y=194.319 2-1.106 6x，R2=0.737 0，P＜0.000 1），10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 组胫骨中钙含量显著低于对照组（0 mg/kg），70 mg组显著低于其他组（P＜0.05）；但蛋壳中钙含量无明显变化。

表3 饲粮镉对蛋鸡粪尿、胫骨、血浆、蛋清、蛋黄、蛋壳中镉残留量的影响Table 3 Effects of dietary cadmium on cadmium residues in feces，urine，tibia，plasma，egg white，egg yolk and egg shell of laying hens

2.3 饲粮镉对蛋壳品质的影响

蛋鸡蛋壳质量结果如表5所示，由表5可知，与对照组（0 mg/kg）相比，10 mg/kg组的蛋壳厚度增加（P＞0.05），30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 组蛋壳厚度无显著变化（P＞0.05）；蛋壳重、蛋壳比重无显著变化（P＞0.05）；30 mg/kg组、50 mg/kg组蛋壳强度显著低于对照组（0 mg/kg），但70 mg/kg组的蛋壳强度与其他处理组差异均不显著（P＞0.05）。

2.4 饲粮镉对胫骨强度的影响

蛋鸡胫骨强度变化如表6所示，由表6可知，各处理组蛋鸡胫骨中端的强度无明显变化趋势（P＞0.05）；与对照组（0 mg/kg）相比，10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg组蛋鸡胫骨两端的强度下降但差异不显著（P＞0.05）。

表4 饲粮镉对蛋鸡粪尿、胫骨、血浆、蛋清、蛋黄、蛋壳中钙含量的影响Table 4 Effects of dietary cadmium on calcium content in feces，urine，tibia，plasma，egg white，yolk and shell of laying hens

表5 饲粮镉对蛋壳品质的影响Table 5 Effect of cadmium of feed on egg-shell quality

表6 饲粮镉对胫骨强度的影响Table 6 Effects of dietary cadmium on tibial strength kg·cm-2

3 讨论与结论

本试验的研究结果表明，随着镉添加量的增加，蛋鸡粪尿、血浆、骨骼、鸡蛋中镉含量均呈线性增加，但鸡蛋中的镉含量远低于我国鲜蛋卫生标准（GB 2743-2003）的规定（0.05 mg/kg）。孙涛[15]等在蛋鸡饲粮中添加 0 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的镉（CdCl2形式），发现蛋清、蛋黄中的镉含量随镉添加量的增加而增多，但均是μg/kg级别，这可能与母体对胎盘的保护机制有关[16]。R.Swiergosz等[17]在秋水鸡的饲粮中添加 0.05 μg/g、40 μg/g、70 μg/g（CdCl2形式），发现股骨和血液中的镉残留量与饲粮中镉添加量和饲喂时间成正比，这些研究表明镉一旦进入机体很难被排出，会在机体组织内蓄积，造成不可逆的组织损伤。

在本研究中，蛋壳中钙含量无明显变化趋势，但蛋壳强度呈下降趋势，可能是因为镉离子Cd2+能够干扰其他二价离子如Ca2+、Cu2+等的代谢，导致蛋壳形成过程中所需要的元素不能有效地被利用[10]。而O.Olgun等[18]也发现，在蛋鸡饲粮中添加0、5、15、和45 mg/kg的镉（CdCl2形式）会引起鸡蛋蛋壳厚度升高，降低蛋壳重和蛋壳强度。本试验的研究结果与之一致。粪尿中钙含量随饲粮中镉添加量的增大呈线性增加，胫骨中钙含量随饲料中镉含量增加呈线性减少；胫骨两端的强度也随镉添加量的增加而呈降低趋势。这表明镉的摄入可能影响了蛋鸡各组织之间的钙含量和转移。去卵巢小鼠经水镉染毒（0 mg/L、20 mg/L、100 mg/L、200 mg/L）导致粪钙及尿钙排泄明显增加，骨钙下降，镉染毒可明显降低去卵巢大鼠股骨颈的骨密度，高剂量组的骨密度显著低于其余各组，骨损伤与镉剂量之间呈显著性负相关[19]，且镉染毒人群或试验动物尿液中钙含量增加，骨骼中钙含量减少[20]，以正常钙水平饲养的成年大鼠为实验动物，镉的注射不仅干扰了骨骺软骨细胞的成熟，而且增加了胫骨小梁区破骨细胞和巨核细胞的数量[21]。说明镉的摄入对机体的钙代谢产生了影响，本试验的研究结果与之一致。镉离子和钙离子具有相似的理化性质，这使得镉离子可直接在质膜、线粒体膜、微粒体膜等钙离子转运、贮存的特殊位置上竞争性取代钙离子[22]。镉可通过多种途径或与多种蛋白作用于细胞，直接或间接改变钙稳态，诱导钙稳态介导的细胞凋亡。镉通过和钙竞争与钙调素结合，干扰钙调素及其调控的生理生化过程，取代钙与肌动蛋白、微丝、微管结合，损害细胞功能，与钙调蛋白结合，激活某些蛋白激酶，进而干扰与钙相关的信息传递系统[23]，但不同细胞的作用路径不同[24]。镉也被认为可以通过与钙的吸收竞争来直接降低胃肠道对钙的吸收，并通过抑制肾脏中维生素D的激活来间接降低钙的吸收[25]，但也有研究认为镉降低1，25（OH）2D3水平与镉对肾脏和骨骼的影响无关系[26]，因此有关镉对机体钙代谢和钙沉积的影响机制还有待进一步研究。

4 结论

在蛋鸡饲粮中添加不同浓度的镉可引起血液、胫骨、粪尿、鸡蛋中镉含量增加（蛋壳镉含量过低未检出），而镉可能抑制了蛋鸡肠道钙吸收，增加了粪尿中钙排泄，导致机体钙负平衡，最终导致胫骨中钙下降。