秸秆与麦粒复配栽培种基质对羊肚菌菌丝酶活性的影响及配方优化

苗人云 ，刘天海 ，唐 杰 ，黄忠乾 ，彭卫红 ，谭 昊 ，3*

（1.四川省农业科学院土壤肥料研究所，成都 610066；2.农业农村部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站，成都 610066；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214062）

羊肚菌属于子囊菌门（Ascomycota），盘菌纲（Pezizomycetes），盘菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌属（Morchella）。目前大规模人工栽培的种类主要包括梯棱羊肚菌（Morchella importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.eximia）。栽培种是羊肚菌栽培的重要一环，栽培种中羊肚菌菌丝的活力最终会影响到收获羊肚菌子实体的产量。目前，国内公开的羊肚菌栽培种配方用到的原料中主料有麦粒、杂木屑、麸皮、玉米芯粉、谷壳、草粉、腐殖土等，辅料包括石膏、碳酸钙、生石灰、磷酸二氢钾、磷酸二氢钙、硫酸镁、羊肚菌基脚土等[1-2]，其组成较为复杂，羊肚菌菌丝在这些配方的基质上的生长效果各有好坏，背后的原因可能是各种天然原材料在营养成分组成上的差异对菌丝生长和活力造成影响。借鉴香菇等食用菌的研究结果，香菇菌丝在分解利用微晶纤维素、木质素磺酸钠、葡萄糖等不同碳源物质时蛋白质分泌组中各种分解酶的表达量各有不同[3]；不同种类的秸秆原料制成的香菇菌棒在营养成分组成、碳氮比等因素上的差异可造成香菇菌丝漆酶、纤维素酶、半纤维素酶等分解酶的活性差异[4]。羊肚菌方面，作者在前期工作中发现不同种类、不同比例的秸秆与麦粒原料复配后的外源营养袋基质在营养成分属性尤其是碳氮比方面存在差异，影响到羊肚菌最终出菇产量的高低差异[5]。综合以上线索，羊肚菌菌种培养基质中可能存在类似的规律，制作菌种基质的秸秆等原料的化学成分属性可能影响羊肚菌分解利用基质的关键酶的产生量，从而间接造成菌丝生长表现的差异。

前期研究中，发现营养袋基质中的羊肚菌菌丝主要产生γ-淀粉酶（EC 3.2.1.3）降解淀粉，而木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是降解半纤维素的主力[6]。在木质素降解方面，羊肚菌的漆酶活性（EC 1.10.3.2）主要由一个AA1_3家族、66 kDa大小的氧化酶蛋白提供[7]。锰过氧化物酶（EC 1.11.1.13）和多功能过氧化物酶（versatile peroxidase，EC1.11.1.16）活性由子囊菌较原始的AA2家族过氧化物酶蛋白提供，不具有像担子菌一样典型的锰过氧化物酶和木质素过氧化物（EC 1.11.1.14）基因[6]。由于栽培种基质与营养袋基质均为富含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉等碳源营养的基质，我们推测上述纤维素酶、木聚糖酶、γ-淀粉酶、漆酶、锰过氧化物酶和多功能过氧化物酶也同样是羊肚菌菌丝分解利用栽培种基质中纤维素、半纤维素、淀粉和木质素的代表性关键酶。分别选用小麦、水稻、玉米和油菜4种作物秸秆为制作羊肚菌栽培种基质的主料，并与麦粒复配。综合菌丝长势和菌核形成情况的外观观察，酶活性水平与活性氧分子含量的测定，以及栽培效果验证，优化获得可应用于实际生产的轻质、高效的羊肚菌栽培种基质配方。

1 材料和方法

1.1 供试品种

试验用羊肚菌品种为六妹羊肚菌“川羊肚菌6号”，其菌株来源于四川省农业科学院土壤肥料研究所。

1.2 供试材料

1.2.1 主要材料及试剂

马铃薯葡萄糖琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司）、油菜秸秆（收割后 6个月使用，含水量为9.37%，颗粒度为＜3 cm的碎片）、水稻秸秆（收割后2个月使用，含水量为8.94%，颗粒度为＜3 cm的碎片）、小麦秸秆（收割后6个月使用，含水量为8.14%，颗粒度为＜3 cm的碎片）、玉米秸秆（收割后2个月使用，含水量为8.20%，颗粒度为＜3 cm的碎片）、麦粒、纤维素酶活性测定试剂盒（CL-2-Y，苏州科铭生物技术有限公司（下同）、木聚糖酶活性测定试剂盒（NEX-2-G）、漆酶活性测定试剂盒（QM-2-G）、锰过氧化物酶活性测定试剂盒（MNP-2-G）、多功能过氧化物酶活性测定试剂盒（LIP-2-G）、γ-淀粉酶活性测定试剂盒（THM-2-G）、过氧化氢含量测定试剂盒（H2O2-2-Y）、超氧阴离子含量测定试剂盒（SA-2-G）。

1.2.2 4种秸秆单独使用或与麦粒复配的栽培种基质

分别以4种作物秸秆，添加或不添加麦粒制成栽培种基质（表1）。其中麦粒添加重量比40%参照贺新生等的羊肚菌栽培种基质无土配方采用的麦粒添加比例[1]。另按照100 g主料添加1.5 g的比例添加石灰作为辅料。分别配制8种配料并装入广口瓶，放入高压灭菌锅中于121℃灭菌150 min，无菌冷却至25℃以下接入母种，放入培养箱22℃避光培养25 d。

表1 4种纯秸秆或秸秆与麦粒复配的羊肚菌栽培种基质主料配方Table 1 Cultivating spawn formula of morel，using straws solely or in combination with wheat grain

1.2.3 油菜秸秆与麦粒按不同比例复配的栽培种基质

以1.2.2试验中筛选获得的油菜秸秆为试验材料，设置5个复配比例（表2），按表2配方并按照100 g主料添加1.5 g的比例添加石灰，分别配制5种配料制成栽培种。

表2 油菜秸秆与麦粒按不同比例复配的栽培种基质配方Table 2 Formula of cultivating spawn substrate made from different proportions of rapeseed straw in combination with wheat grains %

1.3 供试方法

1.3.1 菌种酶活、活性氧分子水平和菌种制作材料营养成分测定

采用浸提法提取栽培种基质中以羊肚菌分泌的胞外酶为主的酶蛋白[6，8]，使用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，参照试剂盒说明书的方法步骤，对纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶、多功能过氧化物酶和γ-淀粉酶（又称糖化酶）的活性进行测定，对过氧化氢、超氧阴离子的含量进行测定。菌种制作材料随机取样，粉碎均匀后，按照苗人云等[5]描述的方法测定其营养成分，以每克干重中的营养成分毫克数表示。碳氮比根据原材料检测结果按各配方中各原料的用量比分别计算出各配方的总碳氮量，然后总碳含量/总氮含量的值即为各配方碳氮比。

1.3.2 农艺性状测定

菌丝生长表现：包括菌丝浓密度和菌核多少，参照李欣然、李书兰等和刘福阳等的方法，对菌丝浓密度和菌核多少以“-”和“+”表示，分为 6个等级：“-”表示无菌丝或无菌核，“+”越多说明菌丝越浓密或菌核数量越多，“+”表示菌丝稀疏或菌核少，“++”表示菌丝较稀疏或菌核较少，“+++”表示菌丝较浓密或菌核较多，“++++”表示菌丝浓密或菌核多，“+++++”表示菌丝很浓密或菌核很多[9，10]。

产量：试验处理鲜子实体的重量。

1.3.3 经济效益

栽培羊肚菌时总产出减去总投入的值即为经济效益。参照刘伟等人的方法[11]，其中总产出即卖出羊肚菌的所得；总投入包括原种成本、原材料、燃料动力、生产人工投入、设施设备占用费、土地租金和棚架设施等各项投入。

1.3.4 栽培试验设计

在观察到表1中添加麦粒的4种配方（B、D、F、H）具有使羊肚菌菌丝酶活性和生长趋势相对增强的基础上，制得4种栽培种，即设计4个处理，每个处理3个重复，每个重复3.0 m2，于2016年10月至2017年4月在四川省简阳市养马镇田家坝村进行栽培试验。

按表2制得5种栽培种基质，每种基质3个重复，每个重复1.5 m2，于 2017年10月至2018年4月在四川省简阳市养马镇田家坝村进行栽培试验。

1.3.5 栽培与出菇管理

按常规生产方法进行生产管理出菇[12]。

1.4 统计分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）：采用MVSP分析软件对配方A～H的营养成分进行主成分分析。

酶活、活性氧分子、产量：采用SPSS18.0分析软件进行单因素方差分析，其中多重比较采用Tukey检验。

2 结果与分析

2.1 不同秸秆对羊肚菌菌丝生长和酶活性的影响

2.1.1 菌丝生长表现

观察栽培种A～H的菌丝生长表现，每个配方观察了10瓶作为重复，发现使用不同秸秆的栽培种基质上生长的菌丝密度和菌核密度存在差异，而在秸秆的基础上添加麦粒辅料后，均表现出菌丝浓密程度和菌核密度增加的情况（表3、图1～图2）。

然后，对潜变量的组合信度进行检验。组合信度主要是评价一组潜在变量的一致性程度，此信度指标是内部一致性的重要指标之一，组合信度越高，表示测量指标间有高度的内在关联，反之亦然。一般认为潜在变量的组合信度值最好在0.6以上，个别显性变量的信度接受值也可采用0.5[24]。分析得知各潜变量的组合信度均在0.7以上，表明变量具有较好的内部一致性。

表3 栽培种基质中的羊肚菌菌丝生长表现Table 3 Growth performances of morel mycelium in the substrates of cultivating spawn

图1 从左到右为纯小麦、水稻、玉米和油菜秸秆为基质的栽培种Figure 1 Frow the left to the right，cultivating spawn with the substrates made from pure straws of wheat， rice， corn， or rapeseed

图2 从左到右为60%小麦、水稻、玉米和油菜秸秆分别与40%麦粒复配为基质的栽培种Figure 2 Frow the left to the right,cultivating spawn with the substrates made from 60%wheat,rice,corn,or rapeseed straw in combination with 40%wheat grains

2.1.2 营养成分及主成分分析

对4种秸秆材料和麦粒的19种营养成分进行检测，根据表1配方换算获得8个配方的19种营养成分，并分别对8个配方的19种营养成分进行比较，结果显示（表4）:纯油菜秸秆配方的纤维素（P＜0.01）和游离脂肪酸（P＜0.05）含量显著高于其他7个配方，而全氮（P＜0.01）、全磷（P＜0.01）、半纤维素（P＜0.05）、不溶性果胶（P＜0.01）、总蛋白质（P＜0.01）和游离氨基酸（P＜0.01）的含量显著低于其他7个配方；油菜秸秆与麦粒复配配方的全碳含量显著高于其他7个配方（P＜0.01）。结果表明，不同秸秆以及是否添加麦粒可能是通过多种营养成分变化的复合因素来共同影响栽培种基质中羊肚菌菌丝的酶活性，碳氮比在其中可能起到一定的影响。

由于制作栽培种基质的秸秆、麦粒等原料营养成分组成较为复杂，对酶活性的影响可能不是简单地由某一两项营养物质的含量比例决定，而是受多种营养物质含量属性协同影响。因此，为了解不同配方之间在营养成分组成方面的相似性和差异性，对8个配方的19种营养成分进行主成分分析。以主成分1为X轴、主成分2为Y轴作图可知，8个配方可分为4类，其中4种纯秸秆配方均在左边，且纯小麦、纯水稻和纯玉米秸秆配方为一类，纯油菜秸秆配方单独为一类；4种秸秆与麦粒复配的配方均在右边，且小麦、水稻和玉米秸秆与麦粒复配配方为一类，油菜秸秆与麦粒复配配方单独为一类，同类中的材料成分相近（图3）。

表4 栽培种基质配方营养成分比较Table 4 Comparison of the nutritional composition of the cultivating spawn formula

2.1.3 酶活性及活性氧分子水平

对比8种栽培种基质的酶活性及活性氧分子水平，结果显示（表5）：对于同一种秸秆，添加麦粒相比不添加麦粒普遍提升了其活性氧分子含量水平（仅水稻秸秆添加与不添加麦粒的过氧化氢含量差异P=0.051，其他3种秸秆添加与不添加麦粒的过氧化氢含量以及所有4种秸秆添加与不添加麦粒的活性氧分子含量差异P值均小于0.05），并在纤维素酶、半纤维素酶（木聚糖酶）、木质素降解酶系（漆酶、锰过氧化物酶、多功能过氧化物酶）和淀粉酶（γ-淀粉酶）6种酶中至少显著提升了3种酶的活性（P＜0.05）。其中油菜秸秆与麦粒搭配使全部6种酶的活性得到显著提升（P值均小于0.01），促进羊肚菌对秸秆基质化的利用。

2.1.4 不同秸秆的栽培种基质对羊肚菌栽培产量的影响

图3 栽培种基质配方主成分分析图Figure 3 PCA scatter plots of the cultivating spawn formula

由表5可知，油菜秸秆与麦粒复配的组合相比其他3种秸秆与麦粒的复配更能较为全面地提升分解纤维素、半纤维素、淀粉和木质素的关键酶的活性水平，可能有助于提高菌丝对栽培种基质的分解利用能力，提升菌丝活力。为验证这4种在酶活性表现上存在明显差异的秸秆麦粒复配组合是否与羊肚菌产量高低趋势一致，开展了田间栽培试验。

表5 栽培种基质中的羊肚菌酶活性和活性氧分子水平Table 5 Enzymatic activities and ROS levels of morel mycelium in the cultivating spawn substrates μg·min-1·g-1

图4 种秸秆与麦粒复配基质栽培种的产量Figure 4 Morel yield of the cultivating spawns made from the four kinds of straws in combination with wheat grains

2.1.5 菌种秸秆材料的选择

从图4中已知，玉米、水稻秸秆分别与麦粒复配基质栽培种的产量显著低于油菜秸秆与麦粒复配基质的栽培种，而小麦秸秆与麦粒复配基质栽培种的产量接近油菜秸秆与麦粒复配基质的栽培种。小麦秸秆已广泛用于食用菌生产、造纸、动物饲料等，而油菜秸秆目前回收利用率较低。综合考虑产量与农业废弃物循环利用因素，选取油菜秸秆与麦粒的搭配，进行进一步的配方比例优化。

2.2 油菜秸秆与麦粒配比优化

根据2.1.5筛选获得适宜制作羊肚菌栽培种的材料为油菜秸秆和麦粒复配，进一步优化油菜秸秆与麦粒的配比。

2.2.1 油菜秸秆与麦粒不同配比的出菇产量

油菜秸秆与麦粒按不同比例复配的栽培种H1～H5栽培羊肚菌均能正常出菇，且产量差异显著，其中麦粒占比25%的配方产量显著高于其他4个配方（P＜0.05）（图 5）。

2.2.2 经济效益

图5 油菜与麦粒复配的5个梯度配方栽培种的产量Figure 5 Yields of five gradient formula of cultivating spawn substrate made from rapeseed straw plus wheat grains

供试5个处理的成本按照2017—2018年四川省成都市周边地区的原种成本、原材料、燃料动力、生产人工投入、设施设备占用费、土地租金和棚架设施等的平均价格计算，鲜销价格按照90元/kg计，进行各处理成本及经济效益分析[11]。由表 6可知，供试各处理的菌种成本在3.46～6.93元/m2，且菌种成本随着秸秆用量的减少而减少；供试各处理的栽培效益在 51.30～73.00元/m2，其中麦粒占比25%的配方（H5）栽培效益最高。综合考量出菇产量与经济效益，主料中油菜秸秆与麦粒的优化配比为 3∶1。

表6 油菜与麦粒复配的5个梯度配方栽培种的成本及效益Table 6 Costs and benefits of five gradient formula of cultivating spawn substrate made from rapeseed straw plus wheat grains,and comparison with the CK commercial cultivating spawn

3 讨论

4种秸秆中加入麦粒后培养羊肚菌，羊肚菌菌丝6种酶活性及活性氧分子含量水平均发生部分或全部提升，说明添加麦粒后极大地提升羊肚菌产生半纤维素、木质素和淀粉降解酶的能力，促进羊肚菌对秸秆基质的利用，与香菇对培养基质利用的研究结果相似[4，13]。试验结果也印证了这6种酶是羊肚菌菌丝分解利用栽培种基质中纤维素、半纤维素、淀粉和木质素的代表性关键酶的推测，与代俊杰的研究结果相符[14]。食用菌菌丝胞外酶与食用菌的生长发育状况密切相关，测定胞外酶活性的大小及动态变化趋势可以侧面反映出菌丝生长的茁壮程度以及生长发育的变化规律[15-16]，且不同基质中食用菌菌丝胞外酶活性存在差异[17-19]，所以以羊肚菌菌丝酶活性的提升来作为选择配方基质的借鉴具有科学依据。对比4种纯秸秆和4种秸秆麦粒复配基质中的羊肚菌菌丝浓度和菌核密度，发现秸秆复配麦粒后均表现出菌丝增浓和菌核增密的情况，这与刘奇正等人的研究结果相符[20]，而菌丝长势、菌核数量与羊肚菌的出菇机制有一定关系[10，21]，且菌核的数量某种程度上代表了可以供给到生殖生长即所要获得的子实体的营养数量[14]，故菌丝长势和菌核数量可以作为评价羊肚菌菌种质量的指标。栽培种基质配方的主成分分析表明，油菜秸秆的营养成分与其他3种秸秆差异较大，加入麦粒复配后仍然如此，而油菜秸秆和麦粒复配后羊肚菌菌丝降解基质中碳源营养的6种关键酶活性和活性氧分子含量水平也明显好于其他3种秸秆与麦粒复配的配方，这种一致性说明了正是因为油菜秸秆较为独特的营养成分组成，使得以油菜秸秆为主料的基质配方相比其他秸秆更能较为全面地提升羊肚菌降解利用菌种基质碳源营养的关键酶的活性，并提升活性氧分子水平从而促进菌核形成。优化获得的羊肚菌秸秆栽培种配方较国内公开的栽培种配方[1-2，10，22]，具有配方简单、麦粒用量少、成本低、质轻便运输的优点，不仅可有效降低栽培者的成本增加效益，还可利用农村大量易得的作物秸秆，有助于农业废弃物循环利用，减少秸秆焚烧，还能少用或不用木屑、刨花等本可制成胶合板材的木质原料，节约林木资源，使羊肚菌制种环节向高效、生态的目标迈进。

综上，本研究通过对不同配方菌种菌丝生长表现、营养成分及主成分分析和酶活性及活性氧分子含量水平比较分析，验证了羊肚菌菌丝分解利用菌种基质的6种关键酶。结合栽培试验验证，证明秸秆作为制作羊肚菌栽培种的材料是可行的，并进一步优化出栽培种基质配方为：主料为油菜秸秆与麦粒重量比3∶1，每100 g主料添加1.5 g石灰作为辅料。