蛙脑膜炎败血金黄杆菌分离株的药敏试验

曾彦钦 林秋娟 潘 平 陈 震 林福忠 蔡鹤鸣 福州市农业科学研究所 福州 350008

蛙脑膜炎败血金黄杆菌（Chryseobacterium meningosepticum of frog）在《伯杰氏系统细菌学手册》第二版中的分类名称是脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica），是蛙白内障-歪头病的主要病原菌。临床上，患蛙的症状为歪头斜颈、白内障、在水面上转圈、皮肤溃烂。大小蛙都会患该病，成蛙更常见，发病率可达50～80%，若无有效治疗，患蛙基本都死亡，蛙场的损失很大。从建阳某蛙场分离出6株蛙脑膜炎败血金黄杆菌，对其进行21种抗生素敏感性试验，现将详情报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药敏纸 由Oxoid ltd.Basingstoke(Hampshire Englang)生产，批号2019-05。

1.1.2 细菌培养和生化鉴定材料 AHM培养基、RS培养基、甲苯胺蓝-DNA酶琼脂、各种细菌生化鉴定管和鉴定试剂，由青岛海博生物技术有限公司生产。麦康凯琼脂、普通营养琼脂、营养肉汤、蛋白冻由北京陆桥技术股份有限公司生产。

1.1.3 健康成蛙 从德化某无病健康蛙场购得，体重175～235 g，每只先喂服红霉素7mg（有效成分），连喂服3 d，再观察7 d，确定健康无病，备用。

1.2 方法

1.2.1 蛙脑膜炎败血金黄杆菌分离与鉴定

1.2.1.1 病原菌分离 无菌操作取患蛙脑组织和心血，分别接种普通营养琼脂、麦康凯琼脂、RS培养基琼脂平板，35℃培养48 h。普通营养琼脂上的菌落光滑圆整、半透明、微隆起、浅黄色、湿润、直径0.8～1.2 mm，接近纯培养。麦康凯琼脂上菌落生长贫瘠，培养72 h后菌落直径0.3～0.5 mm。RS培养基平皿上无菌落生长。

选普通营养琼脂上的典型代表性菌落，以氧化酶试纸和过氧化氢酶试剂检测所选菌落，氧化酶和过氧化氢酶均呈强阳性；挑取氧化酶和过氧化氢酶试验均呈阳性得菌落，再画线接种于普通营养琼脂，培养48 h，获纯培养物。

1.2.1.2 镜检 纯培养物革兰氏染色，12.5×100倍油镜下观察呈革兰氏阴性短小杆菌。

1.2.1.3 细菌生化试验 挑取纯培养物，穿刺AHM试管斜面，接种七叶苷、明胶、葡萄糖、ONPG生化鉴定管。在AHM试管斜面上，48 h，培养基不变色仍为浅紫红色，线状生长不运动，底部生长不良，表层生长良好为好氧，无气泡。24 h七叶苷黑色强阳性，48 h明胶液化（6℃）阳性，ONPG黄色阳性或阴性，72 h葡萄糖发酵弱阳性。其它细菌生化试验结果（48～72 h）为：DNA酶试验阳性、尿素酶试验阳性(初次分离株为阳性，部分菌株传代后转为阴性)、半乳糖发酵弱阳性、果糖发酵弱阳性。枸橼酸盐试验阴性、V-P试验无色阴性、靛基质试验阴性、硫化氢试验阴性、甘油试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、半固体培养基线状生长、蔗糖阴性、麦芽糖阴性、甘露醇阴性、海藻糖阴性、水解淀粉阴性，甲基红试验阴性、阿拉伯糖发酵阴性、水杨苷发酵阴性、乳糖发酵阴性。赖氨酸脱羧酶试验阴性、鸟氨酸脱羧酶试验阴性、精氨酸双水解酶试验阴性。

1.2.2 动物试验 将分离到的3脑株和4脑株（氧化酶、过氧化氢酶、七叶苷、明胶液化、ONPG和DNA酶试验均呈强阳性）分别接种营养肉汤，以其48 h培养物各0.1mL混合成0.2mL，背部皮下注入健康成蛙（试验组4只，对照组3只）。试验成蛙注射菌液后的第24 h，注射局部充血肿胀，48 h后针口破溃发白，72 h后背部皮肤大面积破溃，分别于注射菌液后90～120 h死亡，但无发现歪头和白内障症状。剖检，注射局部皮肤破溃，肝肾充血肿大、有出血斑。无菌采取濒死试验蛙心血，分离出蛙脑膜炎败血金黄杆菌。对照组3只成蛙均存活。

1.2.3 药敏试验 先将6株蛙脑膜炎败血金黄杆菌分别接种于普通营养琼脂平板培养36 h，以接种环钓取菌落混于无菌生理盐水中，再以无菌棉签蘸取菌液，均匀涂抹于普通营养琼脂平板，涂满不留空隙。再以镊子夹取药敏纸片贴在待测菌的琼脂平板上，并用镊子轻压纸片。注意无菌操作和编号。培养24～36 h，测量抑菌圈直经。

2 结 果

2.1 药敏试验结果 红霉素（23.8 mm）、阿奇霉素（20.8mm）为相对高效药物；中效药物从高到低依次为氟苯尼考（19.3 mm）、强力霉素（18.3 mm）、万古霉素（15.5mm）、壮观霉素（14.7mm）、头孢派酮（14.3mm）；低效药物有蒽诺沙星（11.8mm）和阿米卡星（9.8 mm）；庆大霉素（0 mm）、氧氟沙星（4.3mm）、环丙沙星（0 mm）、诺氟沙星（0mm）、头孢噻吩（0 mm）、阿莫西林（0 mm）、氨卞西林（0 mm）、多粘菌素（0 mm）、复方新诺明（0 mm）、四环素（2.6 mm）、杆菌肽（0 mm）、链霉素（4.1 mm）为无效药物。

2.2 治疗效果 根据药敏试验结果，选择相对高效的药物对原发病蛙场（建阳蛙场）进行治疗。按每千克蛙重使用水溶性硫氢酸红霉素20 mg（有效成分）、氟苯尼考可溶性粉20 mg（有效成分），合用治疗。先估算每池蛙的只数，再估算每池蛙的总蛙重，算出每池蛙的2种药用量。先以适量水溶解硫氢酸红霉素和氟苯尼考可溶性粉，再搅拌均匀混入蛙食料。全场用药5 d，停药3 d，再用药3 d。经治疗，蛙群基本停止死亡。停药后，直至蛙售完近50 d，未再使用任何抗生素。

表1 21种抗生素对6株蛙脑膜炎败血金黄杆菌的抑菌圈直径（mm）

3 讨论与小结

1）参照《伯杰氏系统细菌学手册》第二版中的黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）内容，对分离菌进行鉴定，确定其为脑膜炎败血伊丽莎白菌 （Elizabethkingia meningoseptica），即蛙脑膜炎败血金黄杆菌。

2）药敏试验结果表明，分离菌株对抗生素的耐药性很严重，很多在畜牧水产上常用的抗生素如磺胺类、青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类已基本失效，就连目前人医常用的头孢派酮（新药）也只是中效药物。脑膜炎败血金黄杆菌可引起新生儿脑膜炎和医院获得性感染，被感染病人具有较高的死亡率。近些年来，伊丽莎白菌属导致的临床感染越来越多，逐渐引起公共卫生部门的关注[1]。

3）蛙的养殖密度很高，一定要有充足的洁净水源（最好是深井水或水库源头水），不可用别的水产生物养殖场的废弃水。蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的防疫应从水源、引种、隔离、消毒等多方面入手。