不同品种枇杷叶挥发油成分分析

林素英，林毅鑫，林清华，陈 晴

(1.莆田学院 环境与生物工程学院，福建 莆田 351100；2.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建 莆田 351100)

0引言

枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]，别称芦桔、金丸、芦枝等，为蔷薇科常绿乔木植物[1]，枇杷叶主要成分包括黄酮类、三萜酸类、挥发油类、多酚类、有机酸类及倍半萜类等，药理研究表明枇杷叶具有较好的抗炎和止咳作用[2]。近年来研究还发现，枇杷叶有抗病毒、抗肿瘤、降血糖、增强机体免疫功能[3]，以及清除氧自由基、保肝利胆等作用，在临床上运用极广[4]。由于植物的挥发性成分可随空气吸入肺部进入体内，挥发油的成分对药效的影响不可忽视[5]。郭娜的研究表明，挥发油的成分、含量与提取方法、品种、生长阶段有关系[6]。而已有研究大部分只对单个品种枇杷叶的挥发油进行研究[7-9]，或研究多个品种的挥发油成分但未进行定量分析[10]。福建省枇杷资源丰富[11]，有“早钟6号” “长红3号” “白梨” “解放钟”“下花11号”“乌躬白” “香钟”等。为研究不同品种枇杷叶挥发油的组成成分与含量，本研究以“下花11号”“长红3号”“早钟6号”“白梨”“解放钟”五个品种的枇杷叶为材料，采用超声处理后水蒸气蒸馏法进行提取，以正十四烷作为内标物，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对挥发油成分及其相对含量进行分析，研究枇杷叶挥发油化学成分和其相对含量与品种的关系，为枇杷叶合理利用提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

气相色谱质谱联用仪(QP2010 Plus，日本岛津公司)；中药粉碎机(LG-02，上海帅登仪器有限公司)；分析天平(HZ-HS-200S，福建衡之展电子有限公司)；超纯水净水器(AXLC1820，上海富诗特仪器设备有限公司)；超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)；移液枪(10～100μL，德国艾本德公司)；旋转蒸发器(RE-85Z，上海青浦泸西仪器厂)；电热套(KDM，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)。

正十四烷、2-辛醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，GR)；正己烷(天津市河东区红岩试剂厂，AR)；乙醚、无水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，AR)。

1.2 供试材料

五种枇杷叶均由福建省莆田市果树研究所提供，由莆田学院生物技术专业主任林授楷博士鉴定。选择生长一致、管理水平相同的枇杷果树，采摘深绿色的成熟叶，用刷子将其背部绒毛刷掉、洗净，置于烘箱中，在50℃的条件下烘至叶子微黄，将烘干后的叶子放入中药粉碎机中破碎搅匀成粉末，并过40目筛子[12]。将过筛后的枇杷叶粗粉装入封口袋中放置到4℃冰箱中储存，备用。

1.3 挥发油的提取

1.3.1 提取方法

水蒸气蒸馏法：用分析天平精确称取“下花11号”枇杷叶粗粉20.000g于500mL三口烧瓶中，加入160mL的蒸馏水(料液比1∶8)，用保鲜膜封住烧瓶口，放置在4℃冰箱中，浸泡3 h，取出，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集90～100℃馏分[13]，待馏出液澄清后再提取0.5 h[13]，将得到的含挥发油的提取液放置于4℃冰箱中密封避光储存。

超声处理后水蒸气蒸馏法：用分析天平分别精密称取“下花11号”等品种枇杷叶粗粉20.000 g于500mL三口烧瓶中，加入160mL的蒸馏水(料液比1∶8)，用保鲜膜封住烧瓶口，放置在40 kHz超声波中超声振荡40min后放在4℃冰箱中浸泡2 h取出[14]，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，收集90～100℃馏分，待馏出液澄清后再提取0.5 h。得到的提取液用无水硫酸钠进行干燥，用量为1 g/10mL(无水硫酸钠/提取液)，静置0.5 h后，过滤，滤液放置于4℃冰箱中密封避光储存。

1.3.2 萃取方法

在提取液中加入乙醚(体积为萃取液体积的1/2)，振摇，静置10 mim，分离。下层溶液进行再次萃取分离，合并上层溶液，倒入蒸馏瓶中。使用旋转蒸发仪将乙醚蒸出，常压下39℃加热浓缩至乙醚挥发完全。将蒸馏瓶中的挥发油浓缩至1.5mL左右，转移到进样瓶中保存。采用差量法对挥发油进行称量，并根据式(1)计算挥发油得率[15]：

1.4 样品溶液的配制

1.4.1 内标液的配制正十四烷内标液的配制：用移液枪精密移取正十四烷46μL至棕色量瓶中，加入正己烷定容至10mL，得到浓度为3.068mg·mL-1的内标液[16]。

2-辛醇内标液的配制：用移液枪精密移取2-辛醇71μL至棕色容量瓶中，加入正己烷定容到10mL，得到浓度为5.920 mg·mL-1的内标液。

1.4.2 待测溶液的配置

在10mL棕色量瓶中加入枇杷叶挥发油溶液和0.1mL配置好的内标溶液，用正己烷定容至10mL，得到待测液。待测液使用前过0.45μm有机过滤膜。

1.5 GC-MS分析条件

采用自动进样的方法，进样量为1μL，在设定好色谱、质谱条件下，鉴定不同品种枇杷叶挥发油成分、测定各成分相对含量。

色谱条件：色谱柱为HP-5弹性石英毛细管(30.00 mm×0.25 mm，0.25μm)，载气为氦气，体积流速为1mL·min-1，分流比为50∶1，进样口温度设为250℃，接口温度设为250℃，升温程序为40℃保持5min，6℃/min线性升温到160℃，保持5min，10℃/min线性升温到250℃，保持5min。质谱条件：电子轰击EI离子源，离子源温度设为200℃，电离能量为70 eV，溶剂延迟设为2min，扫描质量范围为45～650 m/z(全扫描)。

定性分析：用GC-MS计算机联用仪进行分析鉴定，通过谱库进行自动检索，再结合相关文献进行人工谱图解析，相似度大于90%时确定各品种挥发油成分[17-18]。

定量分析：通过GC-MS数据处理系统，以正十四烷为内标物定量分析，根据式(2)计算挥发油组分的相对含量[19]

2 结果与分析

2.1 内标物的选择

分别采用2-辛醇(浓度为5.920 mg·mL-1)和正十四烷(浓度3.068 mg·mL-1)为内标物，2-辛醇和正十四烷总离子流对比见图1。从图1可以发现，2-辛醇与正十四烷分别在10.054和20.242min出峰，溶剂正己烷在24.050min出峰。两者相比，以正十四烷为内标物，基线更平滑，峰型圆润无分叉，因此选择正十四烷为内标物。

图1 不同内标物的总离子流对比图

2.2 挥发油提取方法对比

用水蒸气蒸馏法和超声处理后再水蒸气蒸馏法分别对“下花11号”枇杷叶的挥发油进行提取，挥发油得率分别为0.27%、0.31%，说明后者可以提高挥发油的提取率。使用乙醚、石油醚萃取均会得到淡黄色混浊液且有浓郁香味的挥发油，但经乙醚萃取的挥发油香味更浓，因此选用乙醚为萃取剂。

同一品种不同提取方法的挥发油总离子流对比见图2。经GC-MS分析可得，水蒸气蒸馏法提取的“下花11号”枇杷叶挥发油中检出34种化学成分，超声处理后水蒸气蒸馏法提取的“下花11号”枇杷挥发油中检出36种化学成分，其中相同的化学成分有25种，主要有橙花叔醇、乳酸异戊酯、膦酰基乙酸三乙酯、1，6-己二醇、叔戊醇、乳酸乙酯、衣康酸单丁酯、巴豆醛、1，3-二乙基苯、乳酸丙酯、丁烯醇、2-辛酮、1，3-环己酸二甲酯、4-甲基苯戊酮、丙酸乙烯酯等，含量最高的成分均为橙花叔醇[20]；含量相近的主要有衣康酸单丁酯、环己醇、丁烯醇、1，6-己二醇、反-氧化芳樟醇等；含量差异较大的主要有1，3-环己酸二甲酯、2-辛酮、乳酸乙酯、乳酸异戊酯、叔戊醇、巴豆醛等。

图2 不同方法提取的挥发油总离子流对比图

实验结果表明，采用不同的提取方法对挥发油的提取率、成分分析、含量都存在着一定的影响。超声处理后水蒸气蒸馏法挥发油得率比水蒸气蒸馏法高0.04%，提取率提高了14.81%，分析出的化学成分和含量都存在一定的差异。

2.3 不同品种枇杷叶挥发油成分及其含量对比

不同品种枇杷叶挥发油总离子流对比见图3，化学成分对比见表1。由表1可知，实验从经过超声处理后水蒸气蒸馏法提取的“下花11号”“长红3号” “早钟6号” “白梨” “解放钟”成熟叶挥发油中分别检出36、25、18、21、25种化学成分，主要为酯类[19](17种)、醇(12种)、酸类(6种)、醛酮类(4种)、其他物质(5种)，其中化学成分相同的有12种，包括橙花叔醇、丁烯醇、丙酸乙烯酯、乳酸丙酯、2-辛酮、叔戊醇、1，6-己二醇、柏木脑等，含量最高的成分均为橙花叔醇，为30.44～284.8μg·g-1，含量相近的有丁烯醇、丙酸乙烯酯、乳酸丙酯、柏木脑等，含量差异较大的有2-辛酮、叔戊醇、1，6-己二醇等。

图3 不同品种枇杷叶挥发油总离子流对比图

在五种枇杷叶的挥发油成分里，“下花11号”所独有的成分有丙烯醛、 (1，1-二甲基乙基)硫代乙酸、反式-2-甲基-2-丁烯酸、环己醇、丙酸丙炔酯、松油醇、邻苯二甲酸丁苄酯；“长红3号”所特有的成分有2-(甲硫基)乙胺、水杨酸乙酯及2，3-二叔丁基对苯二酚，这些都能为枇杷叶的定性判断提供依据。

表1 不同品种枇杷叶挥发油化学成分及相对含量对比

续表1

3 讨论

实验结果表明，挥发油的成分、含量与提取方法、品种有一定的关系。采用超声处理后水蒸气蒸馏法提取挥发油，“下花11号”“长红3号”“早钟6号”“白梨”“解放钟”五种枇杷叶挥发油中分别检测到36、25、18、21、25种成分，共有的化学成分有12种，共同成分的含量分别占总含量的93.4%、95.3%、99.7%、91.8%、95.8%，主要有橙花叔醇、丁烯醇、丙酸乙烯酯、乳酸丙酯、2-辛酮、叔戊醇、1，6-己二醇、柏木脑等。五种枇杷叶挥发油含量最高的均为橙花叔醇，但含量仍有较大差别，其在五种枇杷叶里的含量变幅为30.44～284.80μg·g-1。明确挥发油的成分和含量可更好地探讨其开发利用价值。

在枇杷叶的研究过程中，人们更多关注的是枇杷叶中化学活性成分的提取，以优化提取工艺及研究抗氧化活性为主，往往忽略了不同品种枇杷叶中化学活性成分的差异，前人研究发现得到的成分不尽相同，甚至差异很大，即使相同的成分含量差别也比较大[20]。且大部分使用面积归一化法计算单一品种内各成分的相对含量[5，7-9]，不同研究中的数据无法进行对比分析。本研究中以不同品种的枇杷叶为材料，控制其他研究条件一致(材料采集部位、生长时期、提取方法、分析模式等)，可更好地考察枇杷品种与挥发油成分的关系，同时，研究中采用内标物定量分析，可比较不同品种中各成分的含量，为今后全面认识并合理利用枇杷叶提供了理论依据。