非小细胞肺癌患者血清外泌体中表皮生长因子受体的表达情况及其对NCI-H1299细胞增殖和侵袭的影响▲

路 通 邹志田 裴艳志 乔 峰 朱晓峰

(佳木斯大学附属第一医院胸外科，黑龙江省佳木斯市 154002，电子邮箱：jnlutong0227@163.com)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是发病率和致死率较高的呼吸系统恶性肿瘤，大部分NSCLC患者确诊时已处于中晚期，常伴有远处转移，5年生存率极低[1-3]。近年来研究证实，外泌体中的非编码RNA或蛋白可通过调控肿瘤细胞的恶性生物学行为，进而介导肿瘤的发生发展[4-5]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在多种恶性肿瘤组织和细胞系中异常高表达，包括乳腺癌[6]、胃癌[7]、结直肠癌[8]、肺癌[9]和肝癌[10]等。Zhang等[11]研究发现，胃癌细胞外泌体中EGFR呈高表达，且胃癌细胞外泌体中EGFR过表达可促进肿瘤细胞的增殖和转移。因此，本研究探讨血清外泌体EGFR与NSCLC发生和发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 组织标本及血标本来源 收集2012年1月至2017年12月就诊于佳木斯大学附属第一医院的10例NSCLC患者术前的血清标本(NSCLC组)，患者确诊后均未行任何治疗，其中男性6例，女性4例，年龄(62.62±8.92)岁；并收集15例NSCLC患者(含上述已收集血清标本的10例患者)手术切除的癌组织和距离癌组织3 cm的癌旁组织。所有NSCLC患者均经影像学和病理学资料证实为原发NSCLC。排除标准：(1)入院前已经进行放疗或化疗的患者；(2)不同意参与本研究的患者；(3)不能耐受手术的患者；(4)合并有免疫系统疾病的患者。并收集同期8例健康体检者的血清标本(正常组)，研究对象均无NSCLC及其他疾病，其中男性4例，女性4例，年龄(60.52±9.06)岁。NSCLC组和正常组研究对象的年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)。所有研究对象对本研究知情同意并签署知情同意书，本研究经佳木斯大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；批号：01-055-9A)和胎牛血清(批号：04-011-1A)购自美国Biological Industries公司；青霉素和链霉素混合液购自北京雷根生物技术有限公司(批号：CA0075)；细胞计数检测(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司(批号：CSB-E08986h)；Transwell小室购自美国康宁公司(批号：CLS3396)；TRIzol试剂盒(批号：9108)和定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM(批号：RR037A)购自日本TaKaRa公司；蛋白提取试剂盒(批号：1632086)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)快速制备试剂盒(批号：1610306)购自美国Bio-Rad公司；免疫印迹一抗[抗EGFR抗体(批号：4267)、抗CD63抗体(批号：40623S)、抗CD9抗体(批号：13403)、抗白蛋白抗体(批号：4929)和抗钙连蛋白抗体(批号：2433)]和二抗[羊抗兔IgG(H+L)，批号：14709)]均购于购自美国CST公司；反转录试剂盒购自美国GeneCopoeia公司(批号：QP007)。

1.3 细胞培养 NSCLC细胞NCI-H1299购自北纳生物(货号：BNCC100268)，采用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

1.4 血清外泌体的分离 取1 mL血清标本和9 mL磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)混合于10 mL离心管中，于4℃、3 653 r/min离心10 min(留取外周血单个核细胞)，再经0.45 μM无菌滤膜过滤到10 mL的超滤离心管后，再经3 653 r/min离心20 min去除结晶、细胞和细胞碎片；随后小心地将上清液转移到超速离心管中，于14 704 r/min离心40 min去除大囊泡；留取上清液，于4℃、44 519 r/min离心2 h，留取上清液作为无外泌体血浆，再使用9 mL PBS重悬外泌体，并采用0.22 μm滤膜过滤并转移到干净的超速离心管中，然后于4℃、44 519 r/min再次离心1 h，弃上清液；将所获得的沉淀(即为外泌体)用500 μL PBS重悬，置于1.5 mL EP管内，置于-80℃冰箱备用。

1.5 血清外泌体的鉴定 (1)参考文献[12]的方法，将分离获得的新鲜外泌体溶液20 μL，采用20 μL PBS稀释后滴加到铜网上，室温干燥15 min。PBS清洗铜网3次，加入1%戊二醛固定5 min；蒸馏水冲洗后采用0.4%醋酸双氧铀染色5 min；采用甲基纤维素和醋酸双氧铀的混合物再次染色并包被外泌体样品10 min，室温晾干10 min后采用Tecnai G2 Spirit TWIN透射电镜(美国FEI公司)观察并拍照。(2)采用免疫印迹试验检测外泌体标志蛋白(CD9或CD63)、钙连蛋白和白蛋白。

1.6 相关指标的检测方法

1.6.1 免疫印迹试验：取分离获得的新鲜外泌体20 μL，加入10 μL蛋白裂解液(美国赛默飞世尔公司，批号：89900)于冰上裂解30 min，于4℃、13 423 r/min离心15 min，收集上清。采用二喹啉甲酸法检测样本中蛋白总浓度，计算上样浓度。经SDS-PAGE后转聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，清洗后加入一抗[EGFR(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)、白蛋白(1 ∶1 000)和钙连蛋白(1 ∶1 000)]，4℃孵育10 h后加入二抗(1 ∶500)杂交。化学发光仪(美国Bio-Rad公司，型号：170-8265)成像，并用Image J软件对蛋白条带进行定量。同法检测无外泌体血浆及外周血单个核细胞中的相关蛋白。

1.6.2 实时定量PCR检测NSCLC组织和癌旁组织EGFR mRNA表达水平：采用TRIzol试剂盒提取组织中的总RNA，首先将RNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增。PCR反应体系包括10×扩增缓冲液 10 μL，4种dNTP混合物各200 μmol/L，引物各10～100 pmol，模板DNA 0.1～2 μg，Taq DNA聚合酶2.5 U，镁离子1.5 mmol/L，加三蒸水至100 μL。扩增反应为95℃ 5 min预变性；95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，采用2-ΔΔCt法计算EGFR mRNA的相对表达水平。所使用引物序列见下表1。

表1 PCR引物序列

1.6.3 CCK-8法检测NCI-H1299细胞增殖情况：将对数生长期的NCI-H1299细胞接种于96孔板中，密度为1×104个/mL。分为NSCLC组、正常组、对照组，每组设置5个复孔。待细胞完全贴壁后，采用PBS清洗，并加入100 μL DMEM培养液，然后NSCLC组、正常组分别加入10 μL NSCLC患者血清外泌体悬液或正常健康人外泌体悬液，对照组加入等体积的PBS。分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，并于相应时间点分别加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，用酶标仪(美国Bio-Tek公司，型号：ELX800)检测450 nm处吸光值。每组样品做3次重复。

1.6.4 Transwell法检测NCI-H1299细胞侵袭能力：将对数期NCI-H1299细胞分为NSCLC组、正常组和对照组，用胰酶消化处理后，接种于Transwell小室24孔板内，上室加100 μL(细胞密度为2×105个/mL)细胞悬液，下室加500 μL含10%胎牛血清的培养基，随后NSCLC组、正常组分别在上室中加入100 μL无血清的DMEM培养基重悬的NSCLC患者血清外泌体悬液、正常健康人外泌体悬液，对照组加入等体积的无血清DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后取出小室，棉签擦去微孔膜上室的细胞，PBS冲洗小室上下面各两遍，4%的多聚甲醛固定侵袭并黏附到小室微孔膜下面的细胞15 min，结晶紫染色15 min，PBS冲洗小室，干燥后置于40倍的双目倒置显微镜(上海光学仪器厂，型号：XSP-80A)观察视野下的细胞数目，以穿膜细胞数评估细胞的侵袭能力。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用t检验。采用Pearson检验行相关性分析。将实验数据统计后采用GraphPad Prism 7进行图片绘制。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清外泌体的获取与鉴定 在透射电子显微镜下可见，分离得到的血清中外泌体形态呈圆形或椭圆形(图1)，且血清中多数外泌体粒径在50～130 nm之间(图2)。免疫印迹试验检测结果显示，外泌体标志蛋白(CD9和CD63)在“无外泌体血浆”中有轻微条带，在分离得到的外泌体中高表达；内质网来源的钙连蛋白未在外泌体中检出，这说明这些囊泡并非来源于细胞碎片；白蛋白主要在“无外泌体血浆”中大量检出，同时外泌体标本也有弱条带(图3)。以上结果提示，分泌得到的沉淀是血清中的外泌体。

图1 透射电镜下血清外泌体的形态图2 血清外泌体粒径大小图3 外泌体相关蛋白的表达情况

2.2 血清外泌体中EGFR蛋白表达情况 NSCLC组血清外泌体中的EGFR蛋白相对表达水平为329 197.52±45 220.35，高于正常组的161 446.82±22 173.33(t=3.331，P=0.040)，见图4。

图4 NSCLC患者与健康体检者血清外泌体中EGFR蛋白的表达水平比较

2.3 NSCLC组织中EGFR mRNA表达水平及其与血

清外泌体中EGFR蛋白表达水平相关性 NSCLC组织中EGFR mRNA相对表达水平为5.66±2.46，高于癌旁组织的3.48±2.22(t=2.550，P=0.008)。Pearson相关性分析显示，NSCLC患者血清外泌体中的EGFR蛋白相对表达水平与NSCLC组织中的EGFR mRNA相对表达水平呈正相关(r=0.821，P<0.001)。

2.4 3组NCI-H1299细胞增殖情况比较 培养24 h时，3组NCI-H1299细胞增殖活力比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在培养48 h、72 h、96 h时，NSCLC组NCI-H1299细胞增殖活力高于正常组与对照组(均P<0.05)，而正常组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组NCI-H1299细胞增殖情况的比较(x±s)

注：与正常组、对照组比较，*P<0.05。

2.5 3组NCI-H1299细胞侵袭能力比较 NSCLC组NCI-H1299穿膜细胞数量为(750.21±35.15)个，对照组为(409.52±25.01)个，正常组为(450.04±22.04)个，NSCLC组的NCI-H1299细胞侵袭能力高于对照组和正常组(均P<0.05)，而对照组和正常组的NCI-H1299细胞侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

图5 3组对NCI-H1299细胞侵袭能力比较

3 讨 论

随着医疗水平的提高和科学技术的发展，越来越多的疾病得以治愈，然而目前仍然没有合理的手段治疗肿瘤。NSCLC具有发病率高、预后差、致死率高等特点，目前只有10%～15%的NSCLC患者可在早期确诊后5年内存活，因此NSCLC被公认为对健康危害性最高的恶性肿瘤之一[13-14]。由于NSCLC早期症状并无特异性，大多数NSCLC患者被确诊时已处于中晚期，多伴有远处转移。因此，寻找非侵入性且具有高灵敏度、特异性的分子标志物，是NSCLC临床上迫切需要亟待解决的问题。

外泌体是一种粒径为40～150 nm的细胞外小囊泡，其含有多种成分，包括遗传物质、蛋白质和脂质等[15-16]。不同来源的外泌体通过细胞间的传导、组织间的浸润以及抗原呈递等方式，在多种疾病的发展过程中发挥重要作用[17]。作为有效的信号分子，肿瘤细胞来源的外泌体在肿瘤细胞和构成肿瘤微环境的周围细胞之间发挥作用，肿瘤和间质细胞分泌的外泌体参与了肿瘤进程的各个阶段，并在抗肿瘤治疗中发挥重要作用[18]。外泌体通过与基底细胞进行物质交换，促进血管的生成和血管表皮生长因子的高表达，从而加速肿瘤的发展[19-20]。因此，外泌体中的蛋白质可作为恶性肿瘤的早期诊断分子标志物[21]。Wang等[22]研究发现，乳腺癌患者血清外泌体中CD82明显低于健康者，且CD82可作为乳腺癌精准医学诊断的生物标志物。Kimura等[23]的研究表明，外泌体蛋白CKAP4可作为胰腺癌治疗的分子标志物。Pan等[24]的研究证实，来源于NSCLC细胞外泌体中蛋白MUC1高表达，具有作为NSCLC早期诊断的分子标志物。本研究结果显示，NSCLC患者血清外泌体中的EGFR蛋白表达水平高于正常健康人(P<0.05)，提示EGFR蛋白在NSCLC外泌体中高表达，其或可作为肿瘤早期诊断的标志物。

EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面蛋白，一旦与表皮生长因子结合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。EGFR高表达可促进肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭、迁移和诱导细胞凋亡，与肿瘤的发生发展、放化疗耐受性以及术后预后密切相关[25-26]。靶向抑制EGFR不仅会抑制肿瘤细胞增殖活力，还能够调节肿瘤微环境，进而抑制肿瘤发展进程[11,27]。张自森等[28]发现，抑制EGFR可明显下调胃癌AGS细胞恶性生物学行为，从而增强肿瘤细胞对化疗的敏感性。林珊等[29]研究证实，EGFR靶向抑制剂联合放疗可显著抑制NSCLC细胞增殖和促进细胞凋亡，进而增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。黄邵洪等[30]的研究表明，肿瘤细胞分泌含EGFR外泌体可诱导免疫耐受细胞产生，从而抑制肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞。本研究结果显示，NSCLC患者血清外泌体中的EGFR蛋白相对表达量与NSCLC组织的EGFR mRNA相对表达量呈正相关(P<0.05)，NSCLC组NCI-H1299细胞增殖活力和侵袭能力明显高于正常组与对照组(均P<0.05)，说明NSCLC患者血清外泌体中含有的EGFR表达量与肿瘤组织中的表达量具有一致性，且血清中所含EGFR的外泌体可促进NCI-H1299细胞的增殖和侵袭能力。

综上所述， NSCLC患者血清外泌体中EGFR蛋白表达水平升高，并与肿瘤组织中的EGFR mRNA表达一致，而且NSCLC患者血清外泌体可促进NCI-H1299细胞增殖和侵袭能力。这或为血清外泌体EGFR用于NSCLC的早期诊断以及预后评估提供理论基础。