柠檬桉树脂中多酚的提取纯化及抗氧化活性

(1.桂林理工大学南宁分校， 广西南宁530001；2.广西大学化学化工学院， 广西南宁530004)

柠檬桉(Eucalyptuscitriodira)，又名油桉树，为桉树大家族中的佼佼者，其主要用途为制浆造纸和人造板的原材料[1-2]。对于桉树化学成分的利用，目前已有报道的主要为各种桉树树干、枝叶的挥发油，以及桉树果实中多酚、皂苷等成分的提取分离及抗菌活性研究[3-5]。

在植物成分的提取方面，目前应用较多的方法有溶剂提取法[6]、超声波提取法[7]、临界萃取法[8]等。在粗提物的纯化方面，现阶段常用的纯化方法多为大孔树脂吸附法、液—液萃取法[9]、金属试剂络合沉淀法[10]等。对于柠檬桉树脂的活性研究，国内外文献已有报道的主要为其驱虫活性及抗肿瘤性能[11-12]。而对于柠檬桉树脂中多酚的提取纯化及抗氧化活性研究还鲜见报道，为提高柠檬桉树的综合利用率，本文选择柠檬桉树树脂作为研究对象，对其具有抗氧化活性的多酚成分进行提取和进一步纯化，为柠檬桉树边角料的进一步开发利用提供理论参考依据。

1 实验

1.1 实验原材料

柠檬桉树脂采摘于广西大学校园内。

将柠檬桉树脂固体挑选干净，研磨得到粉末状树脂。

1.2 实验试剂与仪器

主要实验试剂：无水乙醇、98 %(质量分数)浓硫酸、茴香醛、六水合三氯化铁、碳酸钠、冰醋酸、亚硝酸钠、明胶、磷酸钠、30 %(质量分数)过氧化氢、水杨酸、七水合硫酸亚铁、福林酚、无水碳酸钠、钼酸铵、乙酸乙酯、正丁醇、没食子酸、抗坏血酸(VC)等，以上试剂均为分析纯，生产厂家为广东光华科技股份有限公司；二苯代苦味肼基，分析纯，生产厂家为日本Wako公司；芦丁，分析纯，生产厂家为上海柏卡化学技术有限公司。

主要仪器：UV2550型紫外可见分光光度计，生产厂家为日本岛津仪器公司；RE2000E-2L型旋转蒸发仪，生产厂家为河南佰泽仪器有限公司；GE-16A型高速离心机，生产厂家为上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 柠檬桉树脂多酚的提取

准确称取5.0 g柠檬桉树脂粉末，加入一定量的无水乙醇溶液，经常压过滤后，真空浓缩干燥其滤液，即可得到柠檬桉树脂多酚的粗提物，用60 %乙醇溶液溶解粗提物，得到柠檬桉树脂的多酚粗提液[13]。

1.3.2 柠檬桉树脂多酚的定性分析

分别加入1 %的明胶溶液、2 %三氯化铁溶液以及NaNO2—CH3COOH溶液到柠檬桉树脂多酚粗提液中，同步用没食子酸标准溶液作为参照物，摇匀后观察各个试管中溶液颜色的变化[14]。

1.3.3 柠檬桉树脂多酚的定量分析

① 工作曲线的绘制

准确量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL浓度为0.2 mg/mL的没食子酸标准溶液于6个容积为50 mL的棕色容量瓶中，然后在各棕色瓶中依次加入2.0 mL福林酚溶液，4.0 mL质量分数为10 %的 Na2CO3溶液，最后用质量分数为60 %乙醇溶液定容，摇匀后静置40 min。同步用60 %的乙醇溶液作对照。采用紫外分光光度仪在波长650～800 nm范围内确定最大吸收波长，在最大波长处测定其吸光度，并绘制标准曲线[15]。

② 多酚溶液中的含量测定

量取一定体积柠檬桉树脂的多酚提取液，参照绘制标准曲线同样的方法，显色后在最大吸收波长下平行测3次吸光度，计算多酚的平均含量。

③ 精密度实验

准确吸取5份一定体积浓度的没食子酸标准溶液于棕色容量瓶中，用福林酚法[15]显色后，在其最大吸收波长处测定其吸光度，重复测定3次，取平均值，计算其RSD值。

④ 稳定性实验

准确吸取1份一定体积的没食子酸标准溶液，用福林酚法[15]显色后，采用紫外分光光度计测定其吸光度，每隔10 min测一组，每组平行测3次，取平均值，计算其相对标准偏差。

⑤ 加标回收实验

准确吸取5份体积为0.25 mL的粗提液，各加入一定体积的标准溶液，经福林酚法[15]显色后，在其最大吸收波长处测定其吸光度，重复测定3次，取平均值，计算其加标回收率。

1.3.4 粗提液的纯化方法

① 乙酸乙酯萃取提纯法

量取一定体积的多酚粗提液，采用旋转蒸发仪将其减压蒸馏、干燥，加入蒸馏水使其浓缩物溶解，用等体积的乙酸乙酯溶液连续萃取3次，弃去下层液，收集上层萃取相。再用旋转蒸发仪对其减压、浓缩，将其转入质量分数为60 %的乙醇溶液中溶解，即可得到纯化液[16]。

② 醇提水沉—正丁醇萃取提纯法

用100 mL无水乙醇将5.0 g粗提物进行溶解，使用旋转蒸发仪对溶液减压、浓缩、干燥，再用蒸馏水溶解其干燥物，静置至溶液分层，取底层树脂重复2次上述操作，得到醇提水沉的底层树脂，干燥后得到固体物质。将此固体研磨呈粉末状，再用100 mL蒸馏水将粉末溶解，用等体积的正丁醇溶液萃取3次，最后将正丁醇萃取相减压、浓缩，即可得到多酚纯化物[17]。

1.3.5 抗氧化性活性实验

① DPPH·清除率的测定

参照文献[18]测定柠檬桉树脂的多酚粗提物及各纯化物对DPPH·的清除作用，以蒸馏水作为空白，于517 nm波长处分别测定其吸光度。每个浓度测定3次，取平均值。以芦丁和VC作为对照物，根据式(1)计算各物质对DPPH·的清除率η。

(1)

其中：X0、X1、X2分别为DPPH·、样品对DPPH·作用后及样品自身的吸光度。

② 总抗氧化活性的测定

于具塞试管中，分别加入一系列不同浓度的柠檬桉树脂多酚粗提液及各纯化物2 mL，采用磷钼试剂法对不同质量分数多酚的抗氧化活性进行测定。将蒸馏水作为参比溶液，没食子酸作为对照物，计算总抗氧化能力(TA)[19-20]。

(2)

其中：X1为样品吸光度，X2为对照样品的吸光度；V2为反应液总体积；V1为取样量；n为样品测试前稀释倍数。

2 实验结果与分析

2.1 定性实验结果

从定性实验结果可见，滴加了明胶溶液的多酚粗提液和没食子酸标准溶液均有沉淀物质产生；滴加了三氯化铁的两种溶液均变成了蓝色；滴加了NaNO2—CH3COOH溶液的两种溶液均变成了黄色。即加入相同的定性溶液后，柠檬桉树脂的粗提液与没食子酸标准品溶液的变化一致，表明柠檬桉树脂中含有多酚物质[21]。

2.2 定量实验结果

2.2.1 标准曲线的绘制

在最大吸收波长处测定没食子酸标准溶液的吸光度，得到如图1的标准曲线，其曲线方程为Y=145.32X+0.15，r2=0.999 7。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2.2 精密度实验结果

精密度实验结果见表1。从表1可见，精密度实验的RSD为0.61 %(小于5 %)，说明该方法的精密度较好。

表1 精密度实验结果

2.2.3 稳定性实验结果

稳定性实验结果见表2。从表2可见，稳定性实验的RSD为0.92 %(小于5 %)，表明稳定性实验样品在50 min之内的显色稳定性良好。

表2 稳定性实验结果Tab.2 Results of stability test

2.2.4 加标回收实验结果

由加标回收实验结果可知，该实验的回收率均值为100.4 %，说明此方法有较好的准确度，加标回收实验结果见表3。

表3 加标回收实验结果Tab.3 Results of recovery test

2.3 多酚的提取及纯化实验

柠檬桉树脂粗提物中多酚含量为13.37 %,经过乙酸乙酯溶剂进一步萃取提纯后，纯化物中多酚的质量分数为28.31 %，其质量分数为粗提物的2.12倍；经过醇提水沉—正丁醇溶剂进一步萃取提纯后，纯化物中多酚的质量分数为39.65 %，其质量分数为粗提物的2.97倍。结果表明提纯处理后样品中多酚的质量分数较粗提物都有一定的提高。

2.4 柠檬桉树脂多酚抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除作用测定

以VC为参照，考察不同质量分数的多酚粗提物及纯化物对DPPH·的自由基清除效果，实验结果如图2所示。从图2可见，在浓度为0.01～0.14 mg/mL时，各样品浓度与DPPH·的清除能力呈量效关系；在浓度为0.01～0.10 mg/mL时，对DPPH·自由基的清除能力总体上随着各样品浓度的增大而增强；当浓度达到0.1 mg/mL后，醇提水沉—正丁醇纯化物的抗氧化性接近VC并趋于平缓，粗提物与乙酸乙酯纯化物的抗氧化性相差不大。

2.4.2 总抗氧化活性的测定

以VC为参照，考察各多酚提取物的总抗氧化活性。由实验结果可知，在实验浓度范围内，总抗氧化活性随着各样品中多酚浓度的增加而增加。当样品中浓度大于0.04 mg/mL时，粗提物及各纯化物的总抗氧化活性明显增强，VC的总抗氧化能力最强，其次为粗提物，再次为醇提水沉—正丁醇提纯物，最后为乙酸乙酯纯化物，详见图3。

图2 不同浓度试样对DPPH·的自由基清除效果
Fig.2 DPPH scavenging curve ofsamples with different concentration

图3 各样品的总抗氧化能力
Fig.3 Total antioxidant capacityof each sample

3 结论

① 用乙醇作为溶剂，对柠檬桉树脂中的多酚进行提取，可得粗提物中多酚含量为13.37 %；乙酸乙酯纯化后多酚含量为28.31 %，醇提水沉—正丁醇纯化后多酚含量为39.65 %，纯化实验表明，经进一步提纯后，多酚的质量分数有一定程度的提高。

② 定性实验表明，在样品中加入相应的显色物质后，柠檬桉树脂中的多酚粗提液与没食子酸标准品溶液的变化一致，说明粗提物中存在多酚类物质。

③ 定量实验分析中，精密度RSD为0.61 %，小于5 %，说明方法的精密度良好；稳定性RSD为0.92 %，小于5 %，证明样品在50 min之内的稳定性较好；加标回收实验中，平均加标回收率为100.4 %，证明此方法有较好的准确度。

④ 抗氧化活性实验表明,抗氧化能力大小顺序为VC的总抗氧化能力最强，其次为粗提物，再次为醇提水沉—正丁醇提纯物，然后为乙酸乙酯纯化物，没食子酸的总抗氧化能力最弱。各提纯物的活性表现为多酚的质量分数越大，其抗氧化能力越大；多酚粗提物的抗氧化能力较提纯物更强，表明多酚粗提物中可能含有其他更强抗氧化能力的化学成分。