AtNPR1和Cecropin B基因共表达载体的构建

孙立方，柯甫志，聂振朋，王平，孙建华，徐建国

(浙江省柑橘研究所，国家柑橘品种改良中心浙江分中心，浙江 台州 318026)

柑橘病害严重影响其外观、品质和产量，对柑橘生产极为不利。目前，针对柑橘病害采取的措施以利用化学农药为主。筛选抗病品种的柑橘育种有助于品种改良，但存在周期较长、效率低等缺点，而转基因技术等基因工程育种方法能克服传统育种的缺点[1]。利用转基因技术聚合多个抗病基因可显著提高植物的抗病性。在多基因共表达植物载体构建中，以凤仙花种子的一段多肽LP4和有自我剪切功能的口蹄疫病毒片段2A作为连接肽进行多基因融合是一种可以替代传统多基因转化方法的新手段，可以同时连接多个基因并且协同表达[2-5]。而将LP4和2A多肽连接形成新的多肽LP4/2A具两者优势，是一种更为有效的多基因转化连接肽[4, 6-8]。拟南芥中的广谱抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因已分别在多种作物中被证实具有较好的抗病效果[9-10]。因此，本研究将利用基因聚合育种技术来探索提高柑橘对细菌性和病毒性等病害的抗性，利用LP4/2 A作为连接肽，构建AtNPR1和CecropinB基因的共表达植物载体，为后期转化柑橘获得抗病材料做准备。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

本实验所用载体pBI121购买于北京华越洋生物科技有限公司。大肠埃希菌DH5a和农杆菌GV3101感受态细胞购于上海唯地生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

本研究使用的试剂有高保真聚合酶KOD-FX (Toyobo)，PCR产物回收试剂盒D6492 (Omega)，In-Fusion HD Cloning Kit (TaKaRa)，连接酶EL0011 (Thermo Fermentas)和内切酶FastDigest (Thermo Fermentas)。

1.3 载体构建

启动子GRP1.8的编码序列和连接肽(抗菌肽)LP4/2A-Cecropin B的全长编码序列由华大基因科技有限公司合成。以实验室前期构建的质粒为模板重新扩增AtNPR1。利用重叠PCR将AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B连接重组为AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，两端引入XbaⅠ/BamHⅠ酶切位点，并直接连接到载体pBI121，即获得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B载体。利用重叠PCR将GRP1.8和AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B连接重组为GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因，两端引入HindⅢ/BamHⅠ酶切位点，用无缝连接方式连接到载体pBI121，即获得GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B载体。反应体系共50 μL，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；最后72 ℃延伸7 min。实验所用引物由生工生物工程有限公司合成，具体引物列表如下(表1)。

表1 构建所需的引物名称和引物序列

1.4 根癌农杆菌转化

取-80 ℃保存的农杆菌GV3101感受态于冰中融化。每100 μL感受态分别加入1 μg左右上述获得的35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B载体质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5 min、液氮5 min、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min。加入700 μL无抗生素的LB液体培养基，于28 ℃振荡培养2～3 h。6 000 r·min-1离心1 min收菌，留取100 μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含Kan和Rif抗生素的LB平板上，倒置放于28 ℃培养箱培养2～3 d。最后随机挑取单克隆进行PCR验证。

2 结果与分析

实验所构建的载体示意图如下(图1)。载体启动子分别为CaMV 35S和韧皮部特异性启动子GRP1.8。目的基因AtNPR1和CecropinB基因通过连接肽LP4/2 A连接，CecropinB前同时引入信号肽PR1a。实验预期最终分别获得35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物共表达载体。

图1 载体的构建情况

2.1 目的基因扩增和重组

以实验室前期构建的质粒为模板扩增AtNPR1，以人工合成的质粒为模板分别扩增GRP1.8和LP4/2A-Cecropin B片段，分别引入相应酶切位点。设计重叠PCR引物，将AtNPR1和LP4/2A-Cecropin B连接重组为AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(图2)。同样，利用重叠PCR将GRP1.8和重组基因AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B连接，重组为GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B基因(图2)。然后采用酶切连接和无缝连接的方式将这2个重组后的基因分别连接到载体pBI121，下一步进行转化。

M—Marker DL2000; 1—AtNPR1-LP4/2A-CecropinB (2 082 bp); 2—pGRP1.8: AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B (2 684 bp); 3—pGRP1.8 (626 bp)。图2 扩增和重组基因凝胶的回收电泳

2.2 载体转化和PCR检测

将AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8-AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B连接pBI121后的构建载体分别转化大肠埃希菌DH5α。用菌液PCR验证(图3)，并挑取阳性克隆提取质粒后送公司测序，测序结果显示2个构建序列均正确。表明35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B植物表达载体构建成功。

35S为AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B 质粒转化大肠埃希菌DH5α后PCR检测结果(3、5、6为阳性，5号测序正确)；GRP1.8为AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B质粒转化大肠埃希菌DH5α后PCR检测结果(2、5为阳性，2号测序正确)。图3 构建质粒转化大肠埃希菌DH5α后PCR检测结果

挑选上述测序正确的单克隆质粒，分别转化农杆菌GV3101，最后挑取单克隆进行PCR检测。结果表明，所选菌落均为阳性克隆，说明转化成功(图4)。以上结果表明，所构建的植物表达载体35S:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B和GRP1.8:AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B成功转入农杆菌GV3101。

35S为AtNPR1-LP4/2A-Cecropin B质粒转化农杆菌GV3101后PCR检测结果(1、2为阳性)；GRP1.8为AtNPR1-LP4/2 A-Cecropin B质粒转化农杆菌GV3101后PCR检测结果(1、2为阳性)。图4 转化农杆菌GV3101后PCR检测结果

3 讨论

以杂交育种为主的作物传统育种来筛选抗病品种，周期长并且具有很多局限性，柑橘育种也面临同样的问题。近些年基因工程技术在柑橘抗病育种广泛应用，并取得一系列进展。广谱抗病基因AtNPR1和抗菌肽CecropinB基因在作物抗病育种中取得较好的效果，而且分别在柑橘抗黄龙病和溃疡病也有应用[11-13]。LP4/2A在作物多基因转化中被证明可以有效地协调多个基因的共同表达[4,8]。本研究以LP4/2A连接肽为连接肽，成功构建了AtNPR1和CecropinB基因的共表达载体，为以后筛选转基因抗病柑橘准备材料。通过2个抗病基因共同转化柑橘，以期进一步提高柑橘的广谱抗病性。