彭波半细毛羊KAP6.1基因与产毛性状的关系研究

张 立 ，次仁曲珍，洛 桑，次仁多布杰，阿旺扎西

（1.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850000；2.西藏日喀则市江孜县农牧综合服务中心，西藏江孜 857000；3.西藏山南市曲松县农牧综合服务中心，西藏 曲松 856000）

羊毛是重要的畜牧业产品，也是重要的纺织工业原材料。随着羊毛纺织技术的不断提高和人们对自然、高档、轻薄及柔软服饰的追求，直径在21.5 μm以下的细羊毛备受市场青睐。虽然近年来我国的羊毛产量不断增长，但是高品质羊毛产量不足，羊毛质量参差不齐，羊毛进口量逐年攀升。因此，培育出生产高品质、高产量羊毛的绵羊品种成为绵羊育种的时代需求。分子标记育种是实现高品质绵羊育种的重要辅助手段，能够大大加快育种进程[1-6]。

羊毛的细度和卷曲度是羊毛的重要性状，它决定了羊毛产品的纺织品质和经济价值，是世界羊毛业评价羊毛质量的主要依据参数。羊毛纤维品质决定了羊毛制品的最终质量，尤其是羊毛的细度和弹性直接影响着织物的厚度和弹性。随着自然、轻薄高质量毛纺织品成为人们对衣物的主流追求，毛纺业对超细羊毛的要求和需求日益增加。另外，目前人造纤维与羊毛相比较，在纤维弹力和弹力均匀水平方面均占有优势，对羊毛业和羊毛纺织业形成有力竞争，制约了毛纺业的发展。所以，加快生产高品质细毛型羊只的培育和发展，提高细毛羊的育种水平，符合市场的需求，具有较大的发展前景。

1 实验材料与方法

1.1 材料

从西藏江孜县采集53只彭波半细毛羊耳组织。

1.2 样本基因组DNA的提取和纯度测定

使用试剂盒（上海生工生物公司)提取DNA，利用超微量分光光度计 （NANODROP 2000c Thermo SCIENTIFIC）测定基因组DNA的纯度和浓度，其A260/A280在1.8～2.0范围之内，提取的基因组DNA满足实验要求。

1.3 引物的设计合成与检测

根据GeneBank中绵羊的KAP6.1基因 (登录号：AY310752)序列，利用Seqman软件找出突变位点对应在DNA上的位置。利用Primer Design Tool软件设计引物，用于检测KAP基因，引物是由上海生工生物公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

PCR 反应体系为 25 μL：上下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，2×Taq Master Mix12.5 μL，模板 DNA1 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，57.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 HRM分析与检测

1.4.1 DNA HRM-PCR扩增。HRM-PCR扩增反应体系为 10 μL：上下游引物（10 μmol/L）各 0.3 μL，2×HRM Analysis Pre Mix 5 μL，模板 DNA0.5 μL。 PCR扩增条件（二步PCR）：第一步15个循环，第二步25个循环。扩增后的基因片段用常规电泳检测并用Light Scanner TM系统进行分析。

1.4.2 突变样本的常规PCR扩增与测序。通过HRM筛选结果，得出不同基因类型。每种基因类型各选取2个所对应的DNA编号，取其DNA进行常规PCR。常规PCR与引物特异性检测时的程序条件和试剂完全一致。扩增产物经电泳检测后，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA测序验证。

2 结果

2.1 样本基因组DNA的引物检测

如图1和图2所示，扩增片段长度与预期长度吻合，引物扩增产物没有产生明显拖尾及特异性较好。

2.2 HRM分析与基因测序

本实验利用HRM分析系统对所提取的53组彭波半细毛羊羊耳组织DNA样品进行HRM分析。KAP6.1基因突变热点分别在外显子2和外显子 8上。

如图3和图4所示，可看出KAP6.1基因第1078位点核苷酸的基因由T突变为C，其结果与HRM分析结果相一致。

2.3 基因频率与基因型频率

根据测序结果对53只绵羊分型，并统计基因型频率，结果见表2。

表2 KAP6.1基因型频率分布

对每个基因型与毛长度进行分析，结果如表3。

表3 KAP6.1不同基因型与长度关联分析结果

3 讨论

Parsons等[7]认为，KAP6和KAP8基因与细毛羊的产毛量及纤维直径相关，并推测在KAP6和KAP8同一区域可能存在控制羊毛直径的主效基因。刘桂芬[8]和张亚妮[9-10]的研究也表明，KAP1.1、KAP1.3和KAP6.1 基因与细毛羊和绒山羊的部分产毛性状存在一定的相关性。

4 结论

KAP6.1位点与长度性状有关，可作为产绒量性状的首选基因。