致病性大肠杆菌对犊牛肠黏膜功能的影响

崔银雪 ，敖日格乐 ＊，王纯洁 ，斯木吉德 ，阿日查 ，何利娜 ，张 剑 ，刘 波 ，张 晨

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特010018）

诱发犊牛腹泻的因素较多，细菌性腹泻占主导地位[1]。犊牛细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的犊牛急性、接触性及传染性疾病的临床表现。如犊牛败血病常发生于10日龄以内的初生犊牛，初期表现为腹泻，渐渐地体重下降、采食量降低、眼球凹陷和严重脱水，最终衰竭死亡[2]。肠黏膜是动物肠道防御体系的重要组成部分，炎症是肠黏膜伤口的重要表现。肠黏膜受到损伤时，黏膜中包含上皮细胞和免疫细胞在内的多种细胞捕捉炎症细胞产生的信号，进一步传播和放大炎症，同时先天性免疫细胞产生的信号被触发并调整适应性免疫系统，从而导致抗原特异性反应[3]。犊牛早期肠道发育尚不完善，免疫、吸收和分泌等功能与肠道功能关联密切，但是其功能容易因外来致病菌定植而破坏，导致肠道发生炎症反应，继而机体健康受到损伤。因此，本研究以致病性E.coli O1为研究对象，揭示其对犊牛肠黏膜功能的作用机理。

1 材料

1.1 试验动物

2019年9月在内蒙古自治区鄂尔多斯市骑士牧场，选择体况良好、体重相近的48头初生公犊牛为试验动物。

1.2 菌株与试剂耗材

致病性E.coli O1，内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室保存；营养琼脂培养基和营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；牛源ELISA试剂盒，购自江苏酶免实业有限公司。

1.3 试验仪器

净化工作台购自苏州博莱尔净化设备有限公司，生化培养箱购自上海智城分析仪器制造有限公司，全功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，微量移液器购自Eppendorf。

2 方法

2.1 试验动物分组与给药

将实验室保存的致病性E.coli O1接种到固体营养琼脂培养基中，37℃培养24 h，挑单个菌落于营养肉汤中摇床37℃培养24 h，制成悬浮液。将48头初生犊牛随机分为对照组和试验组，每组各24头。试验开始时，试验组犊牛口服混有致病性E.coli O1（2.5×1011CFU/mL，100 mL）的牛奶后正常饲喂，对照组犊牛常规哺乳，持续观察10 d。

2.2 样品采集

犊牛口服后 12 h、36 h、48 h、72 h 和 10 d，采集犊牛回肠组织放入5 mL冻存管中，置于液氮中带回实验室-80℃保存。

2.3 肠黏膜相关指标测定

取冻存于-80℃冰箱的回肠组织0.1 g放入经过高压灭菌处理的研钵中，用少量液氮将其迅速冻结并研磨成粉末状，随后加入0.9 mL经过121℃灭菌的无菌生理盐水充分混匀，制成10%的组织匀浆液。用超声波细胞粉碎机进行超声处理后，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液检测肠三叶因子（ITF）、分泌型免疫球蛋白(SIgA)、紧密连接蛋白Occludin、紧密连接蛋白Claudin-1、紧密连接蛋白ZO-1和细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的含量，检测步骤依照试剂盒说明书进行。

2.4 数据统计与分析

数据用Excel 2016做简单处理，通过SPSS 24.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA，)显著性检验，测定结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05为差异不显著。

3 结果与分析

3.1 致病性E.coli 01对犊牛肠黏膜细胞通透性的影响

致病性E.coli O1对犊牛肠黏膜细胞通透性的影响见表1。由表1可知，试验组Claudin-1浓度在12 h、24 h、36 h 和 48 h 显著低于对照组 （P＜0.05），对照组Occludin和ZO-1浓度在同一时间显著高于试验组（P＜0.05）。

表1 致病性E.coli 01对犊牛肠黏膜细胞通透性的影响

3.2 致病性E.coli 01对犊牛回肠组织细胞因子的影响

致病性E.coli 01对犊牛回肠组织细胞因子的影响见表2。由表2可知，试验组血清中TGF-β在不同时间段与正常组相比差异均显著（P＜0.05），具有统计学意义；IL-10和IL-4随着时间变化有逐渐升高趋势，但是在各时间段均显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 致病性E.coli 01对犊牛回肠组织中IL-4、IL-6和IL-10的影响

3.3 致病性E.coli 01对犊牛肠道SIgA和ITF的影响

致病性E.coli 01对犊牛肠道SIgA和ITF的影响见表3。由表3可知，试验组SIgA浓度在第5天前逐渐降低，随后升高再降低，在同一时间显著低于对照组 （P＜0.05）；ITF浓度在试验组中随着时间变化有逐渐降低趋势，而且低于对照组，同一时间与对照组相比差异极显著（P＜0.05）。

表3 致病性E.coli 01对犊牛肠道SIgA和ITF的影响

4 讨论

4.1 致病性E.coli 01对犊牛肠黏膜细胞通透性的影响

肠黏膜功能不仅能够抵挡外来入侵者进入肠黏膜上皮细胞，还可以促进肠蠕动，当机体受到损伤发生感染时能够导致肠黏膜损伤[4]。紧密连接蛋白是肠黏膜功能极为重要的一部分，能够加强屏障功能，是其结构基础。闭锁蛋白Occludin、Claudin家族与ZO-1和ZO-2等都是紧密连接的重要成员，尽管它们的分子量范围较宽，但是它们在结构上具有相似性，包括2个同型与邻近细胞上的完整膜蛋白相互作用的细胞外环。Occludin是第一个定位于紧密连接原纤维的完整膜蛋白，通过调节细胞通透性发挥重要作用。当其发生异变或者减少时，会增加肠上皮细胞的通透性，导致大分子物质进入其中，肠道受到损伤破坏时可用其作为主要检测指标[5]。试验组Occludin和Claudin-1与对照组相比显著降低，Occludin作为重要的肠道上皮细胞间紧密连接蛋白，与Claudins蛋白在动物肠道细胞膜上大量存在，共同构成选择性屏障，起到增加细胞间的通透性、粘附和移动的作用。ZO-1蛋白不仅参与细胞的物质转运过程，还可以通过C-末端结构域与肌动蛋白F-action直接相互作用，通过N-末端PDZ结构域与其他ZO蛋白和Claudins直接相互作用，促进细胞骨架和TJ复合体之间的分子联系，致病性大肠杆菌能够通过破坏上皮细胞紧密连接蛋白的稳定性而导致紧密连接破坏，与TJs相关的Claudin-1水平降低，对肠道细胞通透性具有一定的影响。本试验中试验组Occludin、Claudin-1和ZO-1水平显著低于对照组，表明致病性E.coli 01能够增加犊牛肠黏膜细胞通透性，破坏犊牛肠道黏膜功能。

4.2 致病性E.coli 01对犊牛回肠组织细胞因子的影响

IL-4是由CD4+T细胞亚群、指定的TH2细胞和嗜碱性细胞产生的能够活化T细胞、B细胞和胸腺细胞的多效性生长因子，也由一种特殊的T细胞亚群所产生。研究表明，IL-4能够抑制单核细胞产生IL-1、TNF-a和IL-6。IL-6是具有调节免疫系统和机体代谢的多种活性细胞因子，直接参与局部或全身急性炎症反应，也参与组织炎症浸润等其他炎症方面的调节，是急性反应的诱导因子。IL-10是在控制肠道抗原刺激反应中起着关键作用的免疫调节性细胞因子，能够终止炎症反应和恢复T细胞对肠道细菌的耐受性。炎症细胞因子在组织中扩散后共同作用，以诱导上皮损伤，激活局部巨噬细胞，成纤维细胞和内皮细胞也被相继激活产生介质，从而促进整体免疫反应和持续性炎症。本试验发现试验组IL-4和IL-10水平显著低于对照组，IL-6水平显著高于对照组，表明犊牛感染致病性E.coli 01能够促进促炎因子，抑制抗炎因子的产生，进而促发炎症反应。

4.3 致病性E.coli 01对犊牛肠道SIgA和ITF的影响

黏膜中的SIgA是一种针对外在性病原体和抗原的一线防御中的黏膜表面分子，既可以非特异性免疫消除具有免疫排斥的病原体，又可以在病原体引起的特异性免疫中发挥作用，是具有独特结构和功能特征的一级抗体[6]。本试验中试验组SIgA水平显著降低，说明致病性E.coli 01能够降低肠黏膜免疫防御功能。ITF在哺乳动物的多种组织中广泛存在，主要存在于动物小肠和大肠的黏膜细胞中，由肠道黏膜杯状细胞合成并分泌，是杯状细胞分泌到小肠和大肠腔中的蛋白酶抗性因子，能够促进细胞增殖和重建区域上皮细胞，对细胞有保护作用[7]。ITF能够增强浅表细胞的抵抗力，降低上皮细胞的通透性，在肠黏膜损伤中加强细胞与细胞的连接[8]，促进细胞的迁移和抑制细胞凋亡来实现促进上皮细胞修复和生长，与黏蛋白作用形成黏液胶层，进而增强肠黏膜功能的作用[9]。此外有研究表明，ITF在肠道中抑制肠道促炎因子的分泌使炎症反应减轻。当多种肠道损伤显著增加时，ITF可以防止肠上皮损伤和促进修复。本研究中试验组ITF浓度显著低于对照组，说明致病性E.coli O1能够显著降低ITF水平，降低其对细胞的修复作用，与黏蛋白的结合降低，进而对肠黏膜功能的作用降低，使其在肠道发生炎症反应时修复功能减弱。

5 结论

综上所述，致病性E.coli 01能够增加犊牛肠黏膜细胞的通透性，降低SIgA的合成，抑制ITF对细胞的修复，促进炎症反应，进而损伤肠黏膜功能。