甲巯咪唑对初诊Graves

姜丽莉 王静 李振凤 周齐 栾雪静 任新雯

摘要：目的  探討甲巯咪唑对初诊Graves'病患者血清相关细胞因子及microRNAs（miRNAs）水平的影响。方法  选取2016年12月～2019年1月于海阳市人民医院内分泌科就诊的36例Graves'病初诊患者为疾病组，给予甲巯咪唑治疗。另选取同期30例健康志愿者作为健康对照组。比较疾病组治疗前、治疗后及健康对照组甲状腺功能指标[游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、促甲状腺激素受体抗体（TRAb）]、细胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]的水平。结果  疾病组治疗前FT3、FT4，TRAb，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP，miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康对照组，TSH、IL-2及miR-146a水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。疾病组治疗后FT3、FT4、TRAb、IL-6、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-142-3p、miR-155水平低于治疗前，而TSH、IL-2、miR-146a水平高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）;IL-17水平治疗前后比较，差异无统计学意义（P>0.05）。疾病组治疗后TSH、IL-2、miR-146a水平低于健康对照组，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-155水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两组FT3、FT4、TRAb及miR-142-3p水平比较，差异无统计学意义表（P>0.05）。结论  甲巯咪唑可改善Graves'病患者的甲状腺功能，血清相关细胞因子及miRNAs可作为该病临床诊疗的辅助指标。

关键词：Graves'病;甲巯咪唑;细胞因子;microRNAs

中图分类号：R511.5                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.031

文章编号：1006-1959（2020）08-0101-04

Abstract：Objective    To investigate the effect of methimazole on serum-related cytokines and microRNAs（miRNAs） in newly diagnosed Graves' disease patients.Methods  From December 2016 to January 2019，36 newly diagnosed patients with Graves' disease who were treated in the Department of Endocrinology of Haiyang People's Hospital were selected as the disease group and treated with thiamazole.Another 30 healthy volunteers in the same period were selected as the healthy control group.Comparision of thyroid function indexes before treatment ，after treatment of disease group and healthy control group[free triiodothyronine（FT3）， free thyroxine（FT4）， thyroid stimulating hormone（TSH），thyrotropin receptor antibody （TRAb）]，Cytokines [IL-2，IL-6，IL-17，TGF-β1]，hs-CRP，microRNAs[miR-16，miR-142-3p，miR-146a，miR-155].Results  Before treatment，the levels of FT3，FT4，TRAb，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were higher than those of healthy controls，TSH，IL- 2 and miR-146a levels were lower than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.After treatment，the levels of FT3，FT4TRAb，IL-6， TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were lower than before treatment，the levels of TSH，IL-2 and miR-146a were higher than before treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）; the IL-17 level before and after treatment had no significant difference（P>0.05）. After treatment，the levels of TSH，IL-2，miR-146a in the disease group were lower than those in the healthy control group，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP， miR-16，miR-155 were higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in FT3，FT4，TRAb and miR-142-3p levels between the two groups（P>0.05）. Conclusion  Thiamazole can improve thyroid function in patients with Graves' disease.Serum-related cytokines and miRNAs can be used as auxiliary indicators for clinical diagnosis and treatment of this disease.

Key words：Graves' disease;Methimazole;Cytokines;microRNAs

Graves'病（graves' disease，GD），又称毒性弥漫性甲状腺肿，是一种器官特异性自身免疫性疾病，是甲状腺功能亢进症最常见的类型，约占甲亢的85%。近年来GD发病率逐年升高，并呈现年轻化趋势[1]。该病临床主要表现为高代谢症候群、弥漫性甲状腺肿、眼征、皮损及胫前粘液性水肿。针对该病，目前主要治疗方法包括抗甲状腺药物、放射性核素碘、手术及介入栓塞。其中以抗甲状腺药物疗法最为安全方便，且治疗过程中不会造成永久性甲减而得到广泛应用。抗甲状腺药物中甲巯咪唑因安全性相对较好、药效稳定、半衰期长、患者的依从性较好而被推荐作为临床治疗甲亢的首选药物[2]。有研究表明，表观遗传、环境和免疫学因素在GD发病机制发病中起着重要作用，多种免疫细胞和细胞因子共同参与了GD的发病，尤其是T淋巴细胞及其相关细胞因子，如IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1[3]。除细胞因子外，miRNAs直接或间接参与了固有性及适应性免疫应答，从而可能在自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要的负调控作用。越来越多的研究证实，miRNAs异常与GD的发生密切相关，研究较多的有miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155[4]。本研究通过检测IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1等细胞因子、hs-CRP及miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155等miRNAs的表达水平，观察甲巯咪唑治疗GD病的临床效果，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料  选取2016年12月～2019年1月于海阳市人民医院内分泌科就诊的36例Graves'病初诊患者为疾病组，疾病组男性7例，女性29例;年龄19～68岁，平均年龄（38.41±11.81）岁，另选取同期30例健康志愿者为健康对照组，其中男性6例，女性24例;年龄18～60岁，平均年龄（39.06±11.17）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。疾病组患者均符合2008版《中国甲状腺疾病治疗指南》中GD病的诊断标准，无手术治疗史及合并严重心肺功能不全。健康对照组无新近感染，且无甲状腺疾病和家族史。所有研究对象均排除感染、妊娠、肿瘤、过敏性疾病以及其它免疫性疾病，6个月内均未使用激素及免疫抑制剂。所有参与者均签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本收集  所有研究对象均于清晨空腹采集肘部静脉血5 ml，3000 r/min 离心10 min，分离血清并分装，-80℃保存待测。

1.2.2甲状腺功能相关指标测定  采用BECKMAN COULTER UniCel DXI800全自动化学发光仪与配套试剂对所有研究对象进行FT3、FT4以及TSH定量测定。采用罗氏Cobas e411电化学发光全自动免疫分析仪与配套试剂对TRAb进行定量测定。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 hs-CRP测定  采用免疫透射比浊法进行hs-CRP的检测。选用BECKMAN COULTER AU5800全自动生化仪及伊普诺康生物试剂盒，检测步骤参照说明书进行。

1.2.4细胞因子的测定 以 IL-2测定为例，应用Human IL-2 ELISA Kit（联科生物）进行浓度定量测定，检测方法为ELISA，检测步骤参照说明书。绘制血清样本标准曲线，使用Thermo Scientific multiskan go全波长酶标仪在450 nm及570 nm处进行双波长吸光值测定并计算待测细胞因子浓度。IL-6、IL-17、TGF-β1检测步骤同上。

1.2.5 miRNAs的测定  ①RNA提取：采用Trizol法提取血清样本中的总RNA。取-80℃保存的血清200 μl，加1 ml Trizol混合均匀，提取过程参照说明书。提取的总RNA应用Nanodrop OneC超微量可见分光光度计检测其在波长260 nm及280 nm 处的吸光度比值以验证其纯度。②逆转录及荧光定量PCR：将提取的总RNA进行逆转录，以U6为内参，反转录过程参照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）说明书，反应条件：42℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保存。荧光定量PCR按照QIAGEN QuantiNova  SYBR  Green PCR说明书进行，反应条件为95℃ 2 min，95℃ 5 sec，60℃ 10 sec，40个循环。

1.3观察指标  比较疾病组治疗前、治疗后及健康对照组甲状腺功能指标[游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、促甲状腺素受体抗体（TRAb）]、细胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]。

1.4統计学方法  采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料用（n）表示，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1甲状腺功能指标水平  疾病组治疗前FT3、FT4，TRAb水平高于健康对照组，TSH水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后FT3、FT4以及TRAb水平低于治疗前，TSH水平高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后TSH水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两者FT3、FT4、及TRAb水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2血清細胞因子及hs-CRP水平  疾病组治疗前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康对照组，IL-2水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。疾病组治疗后IL-2水平高于治疗前，IL-6、TGF-β1、hs-CRP水平低于治疗前，差别有统计学意义（P<0.05），治疗前后IL-17水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;疾病组治疗后IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康对照组，IL-2水平低于健康对照组（P<0.05），见图1。

2.3 miRNAs的表达水平   疾病组治疗前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康对照组，miR-146a水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治疗前，miR-146a水平高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后miR-16、miR-155水平高于健康对照组，miR-146a水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两者miR-142-3p水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

3讨论

目前，临床上GD治疗主要依据血清中甲状腺激素水平的变化，然而后者的指示作用存在一定局限性。多项研究证明，细胞因子及miRNAs在GD发病过程中起着重要的调节及介导作用。故本文通过测定血清中细胞因子及miRNAs在甲巯咪唑治疗前后表达水平的变化，探究其在GD诊疗中的作用。甲巯咪唑是目前临床上治疗GD的主要药物之一，具有抑制甲状腺腺泡内过氧化物酶、阻碍T3、T4合成及轻度的免疫抑制作用。本研究显示，GD患者在经甲巯咪唑治疗6个月后，FT3、FT4以及TRAb水平均低于治疗前，而TSH水平高于治疗前，说明甲巯咪唑可抑制甲状腺激素的合成，改善患者的甲状腺功能。

GD通常被认为与遗传、外界环境变化以及自身免疫系统异常有关。免疫系统异常主要是免疫细胞及细胞因子失衡。IL-2水平增高通常可以提示某种自身免疫性疾病。IL-6可增加T细胞表达IL-2及IL-2受体（IL-2R），并参与刺激免疫反应的细胞增殖、分化及自身抗体产生[5]。IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，通过促进炎症因子分泌将中性粒细胞招募至炎症部位形成炎症反应，并参与介导自身免疫性疾病的发生发展[6]。hs-CRP常作为炎性反应的一个重要指示[7]。本研究中，疾病组治疗前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP较健康对照组表达升高，IL-2降低，说明这些细胞因子可能参与了GD发生并促进其发展。治疗后，IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP较治疗前降低，IL-2升高，说明甲巯咪唑具有免疫抑制作用。而IL-17水平变化不明显，这可能与甲巯咪唑不能抑制外周血中IL-17分泌有关。同时，GD患者治疗后尽管甲状腺功能回归正常，但机体免疫失衡依旧存在。

大量研究表明，miRNAs在自身免疫疾病的发生中起关键作用，大多参与调节免疫细胞的分化或激活免疫反应，但其与GD相关的研究还很少[8]。miR-16可参与炎症因子及趋化因子生成[9]，miR-142-3p削弱了调节性T细胞（Regulatory T cells，简称Tregs）对CD4+CD25T细胞增殖反应和细胞因子产生的抑制作用。既往文献证实GD患者Treg细胞抑制功能受损[10]，说明miR-146a可能参与CD4+T细胞功能异常，进而影响炎症发展[11]。miR-155被认为与天然免疫应答密切相关，其表达失调可引起炎症及多种自身免疫性疾病。本研究中发现miR-16、miR-142-3p、miR-146a及miR-155表达水平在治疗前后均发生了显著变化，疾病组治疗前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康对照组，miR-146a水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治疗前，miR-146a水平高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）;疾病组治疗后miR-16、miR-155水平高于健康对照组，miR-146a水平低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两者miR-142-3p水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明上述miRNAs可能在GD的发生发展中发挥重要作用，可能通过损害GD患者的CD4+T细胞功能而加重免疫功能亢进。同时，甲巯咪唑治疗后，miRNAs较治疗前有显著性差异，表明miRNAs可能是甲巯咪唑治疗GD的作用机制之一。

综上，甲巯咪唑可改善GD病患者的甲状腺功能，血清相关细胞因子及miRNAs可作为GD病临床诊疗的辅助指标。

参考文献：

[1]Burch HB，Cooper DS.Management of Graves Disease：A Review[J].The Journal of the American Medical Association，2015，314（23）：2544-2554.

[2]Bartalena L.Diagnosis and management of Graves disease：a global overview[J].Nature Reviews Endocrinology，2013，9（12）：724-734.

[3]Naik V，Khadavi N，Naik MN，et al.Graves' disease：clinical manifestations， immune pathogenesis （cytokines and chemokines）and therapy[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2008，18（9）：967-971.

[4]Qin Q，Wang X，Yan N，et al.Aberrant expression of miRNA and mRNAs in lesioned tissues of Graves'disease[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（5）：1934-1942.

[5]Merrill SJ，Minucci SB.Thyroid autoimmunity： an interplay of factors[M].Vitamins and hormones.Academic Press，2018（106）：129-145.

[6]操伟庆，季榕.白细胞介素17及其与多种疾病的关系[J].现代临床医学，2017，43（4）：246-250.

[7]Czarnywojtek A，Owecki M，Zgorzalewicz-Stachowiak M，et al.The Role of Serum C-Reactive Protein Measured by High-Sensitive Method in Thyroid Disease[J].Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis，2014，62（6）：501-509.

[8]Hiratsuka I，Yamada H，Munetsuna E，et al.Circulating microRNAs in Graves' disease in relation to clinical activity[J].Thyroid，2016，26（10）：1431-1440.

[9]Yamada H，Itoh M，Hiratsuka I，et al.Circulating micro RNA s in autoimmune thyroid diseases[J].Clinical Endocrinology，2014，81（2）：276-281.

[10]Chen X，Huang F，Qi Y，et al.Serum and thyroid tissue level of let-7b and their correlation with TRAb in Gravesdisease[J].Journal of Translational Medicine，2018，16（1）188.

[11]Zheng L，Zhuang C，Wang X，et al.Serum miR‐146a，miR‐155，and miR‐210 as potential markers of Gravesdisease[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis，2018，32（2）：e22266.

收稿日期：2020-03-03;修回日期：2020-03-17

編辑/李国苗