基于Hedgehog通路探讨补肾活血方对实验性膝骨性关节炎兔退变软骨的保护作用*

贺自克，王上增，沈锦涛

（河南省中医院关节科，河南郑州450000）

膝骨性关节炎属于退行性骨关节疾病，在中老年人中患病率较高，严重影响患者生活，给家庭、社会带来一定的负担［1］。目前国内外学者主要从细胞因子、基质金属蛋白酶、免疫反应等方面探究膝骨关节炎发病机制，然而尚未有统一定论。近年来发现Hedgehog通路在膝骨关节炎的发生中扮演重要角色，研究显示Hedgehog通路激活后可诱导大鼠关节软骨损伤，而抑制Hedgehog通路活化则对软骨具有保护作用，推测Hedgehog通路在软骨退变中发挥重要作用［2］。镇痛药及非甾体药物是目前治疗膝骨关节炎常用的方法，但仅能缓解关节炎的发展，不能达到治愈的目的，因此减轻膝骨关节炎的软骨退变，诱导损伤软骨修复，是治疗膝骨关节炎的关键［3］。补肾活血方（Bushen-Huoxue prescription，BSHX）主要由熟地黄、丹参等中药组成，具有活血、镇痛、消炎、行气散寒等功效，在骨关节炎治疗中应用较多［4］，然而具体作用机制目前尚不明确。本研究通过复制膝骨性关节炎动物模型，并给予BSHX干预，旨在探究BSHX对膝骨关节炎退变软骨的保护作用及可能的作用机制。

材料和方法

1 动物及药物制备

30只雄性新西兰兔，SPF级，10周龄，体质量（2.0±0.2）kg，购于河南省康华药业股份有限公司，许可证号为SYXK（豫）2017-0015，动物饲养室温为20～22℃，空气湿度为40%～60%，饲养1周后造模。

补肾活血方包含：桑寄生、积血、熟地黄、龟板、黄芪、白芍各30 g，阿胶、怀牛膝、补骨脂各20 g，地龙15 g，丹参、仙鹤草、当归各10 g。加水浸泡上述药材，温火煎煮1 h，过滤后加水再次煎煮30 min，收集两次药液，浓缩后依据人与兔体表面积换算法，给药剂量为1.86 g/kg（生药量）［5］。

2 主要试剂及仪器

Hedgehog通路激活剂 SAG（912545-86-9）购于MCE；TRIzol试剂（DP424）购于北京天根生化科技有限公司；BCA检测试剂盒（SP900）、RIPA裂解液（PP1901）、免疫组化检测试剂盒（PV6000）、HE染色试剂盒（C0105）及 TNF-α（PT516）和IL-Iβ（PI130）检测试剂盒均购于碧云天生物技术研究所；番红O染色试剂盒（G1371）购于北京索莱宝有限公司；兔抗Shh抗体（SAB2108581）、Ptch1抗体（SAB2501613）、Smo抗体（SAB1412475）、Gli1抗体（HPA068903）和β-actin抗体（A5316）均购于Sigma-Aldrich；兔抗基质金属蛋白酶13（matrix metalloprotein-13，MMP-13）抗体（ab237604）和II型胶原（collagen type II，Col-II）抗体（ab198200）购于Abcam。2500凝胶成像仪和EPS300垂直电泳仪购自于Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 动物模型制备 从30只新西兰兔中随机抽取6只作为对照（control）组，其余24只参照Hulth法［6］制备膝骨关节炎模型，模型组兔仰卧手术台，麻醉后去除右肢后方膝关节内侧绒毛，于髌骨内制做纵向1 cm切口，逐层剥离后暴露内侧副韧带并剪断，切开关节囊将内侧半月板完全切除，同时将前后交叉韧带剪断，用生理盐水冲洗关节，消毒后缝合切口，采用无菌敷料加压固定。造模后连续3天注射青霉素（8×104U/d），隔天换药，2周后拆线，兔出现典型膝骨性关节炎表现（关节肿胀，关节活动度降低，皮温升高），则视为模型成功。control组兔仅进行麻醉，切开膝关节皮肤，不做其它处理。

3.2 动物分组与给药 造模8周后，将24只模型兔分为模型组（model组）、BSHX组、SAG组和BSHX+SAG组，每组6只。BSHX组：灌胃BSHX，剂量为1.86 g/kg；SAG组：灌胃SAG溶液，剂量为20 mg/kg［7］。BSHX+SAG组：灌胃 1.86 g/kgBSHX与 20 mg/kg SAG。Control组和model组灌胃等量生理盐水。各组均连续给药8周。

3.3 兔膝关节宽度则定 末次给药结束后，由两名工作人员用标尺测量各组兔膝关节宽度，记录数据，重复测量3次，求取平均值。

3.4 膝关节大体情况观察 各组兔处死后获得右膝关节，观察软骨表面颜色、光滑度、光泽、溃疡等变化，依据Pelletier评分［8］对软骨退变情况进行评定；参照软骨分级标准［9］，将软骨表面状态分为4个等级，等级越高代表软骨退变越严重。

3.5 软骨组织病理形态学观察 截取胫骨近端1/4处到股骨远端1/4处膝关节，一部分膝关节软骨组织置于-80℃保存，另一部分膝关节软骨组织10%多聚甲醛固定。取出固定软骨组织，经脱钙、水合、透明、石蜡包埋后制备膝关节软骨组织石蜡切片，厚度为5 μm，参照试剂盒进行HE染色和番红O染色。依据Mankin评分［10］对兔膝关节软骨组织细胞、潮线、基质染色等情况进行评定，评分为0～13分，评分越高，代表软骨组织退变越严重。

3.6 酶联免疫法检测软骨组织匀浆中TNF-α和IL-1β水平 从-80℃冰箱取出软骨组织，称取1 mg，添加9 mg/L生理盐水，在匀浆器内制备组织匀浆液，5 000×g离心10 min，收集上清，采用酶联免疫检测试剂盒对TNF-α和IL-1β水平进行测定。

3.7 免疫组化法检测软骨组织中MMP-13和Col-II蛋白表达 将石蜡切片烘烤后，经脱蜡、水合后在热柠檬酸盐缓冲液中修复2 min，添加3%过氧化氢室温下反应15 min，添加山羊血清封闭抗原后，室温下加入I抗（1∶500稀释），4℃冰箱中孵育16～18 h，添加II抗（1∶5 000稀释）室温下孵育1 h，DAB显色后，水洗添加苏木素染色、温水返蓝，切片经脱水、透明、中性树脂封片后在显微镜下观察蛋白染色情况，MMP-13和Col-II主要定位在细胞质内，细胞质内出现棕黄色或棕褐色视为阳性染色细胞。采用ImageJ软件定量评估阳性表达率，阳性表达率（%）=细胞阳性数/细胞总数×100%。

3.8 Western blot法检测软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达 采用RIPA裂解液提取膝关节软骨组织全蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，经SDSPAGE后，将目的蛋白转移至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭膜后，I抗（抗Shh、Ptch1、Smo和Gli1抗体，均1∶500稀释）4℃孵育膜过夜，用II抗室温孵育膜1 h，经ECL发光液显色后，在凝胶成像仪中采集保存图像，以β-actin为内参照，利用ImageJ软件分析蛋白相对表达量。

4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两对比采用SNK-q检验。当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 兔膝关节一般情况

肉眼观察可见，control组兔膝关节大体正常，未出现畸形、肿胀等；model组兔膝关节出现肿胀，皮肤充血，行走出现轻微跛行；经BSHX治疗后，膝关节肿胀和皮肤充血均得到一定缓解，无明显跛行；SAG干预后兔膝关节肿胀、充血更为严重，出现较明显跛行；BSHX+SAG组兔膝关节得到缓解，但效果不显著。与control组相比，model组膝关节宽度显著增大（P＜0.05）；与model组相比，BSHX组膝关节宽度显著减小，SAG组膝关节宽度显著增大（P＜0.05）；BSHX+SAG组膝关节宽度显著小于SAG组（P＜0.05），见表1。

表1 各组兔膝关节宽度对比Table 1.Comparison of knee joint swelling in rabbits of each group（Mean±SD.n=6）

2 膝关节软骨大体情况

与control组相比，model组软骨退变评分和软骨分级显著升高（P＜0.05）；与model组相比，BSHX组软骨退变评分和软骨分级显著降低，SAG组软骨退变评分和软骨分级显著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG组软骨退变评分和软骨分级显著低于SAG组（P＜0.05），见表2。

表2 各组兔软骨退变情况比较Table 2.Comparison of cartilage degeneration in rabbits in each group（Mean±SD.n=6）

3 膝关节病理形态学观察

HE和番红O染色均显示，control组软骨组织结构清晰，骨膜完整光滑，细胞排列整齐，潮线完整清晰，染色均匀；model组软骨组织结构不清晰，细胞排列紊乱，体积增大，潮线不清晰，细胞质基质染色变浅；经BSHX干预后软骨组织及细胞形态均得到一定改善，细胞质基质染色变深；SAG组软骨表层损伤较严重，细胞成簇增殖，形态不规则，潮线不完整或消失，细胞质基质染色不均；BSHX+SAG组软骨组织及细胞形态损伤有所减轻，但变化不显著，见图1、2。

Figure 1.The pathological changes of cartilage tissues observed by HE staining（scale bar=50 μm）.The articular cartilage is indicated by the box.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.图1 HE染色观察软骨组织病理学变化

与control组相比，model组Mankin评分显著升高（P＜0.05）；与model组相比，BSHX组Mankin评分显著降低，SAG组Mankin评分显著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG组Mankin评分显著低于SAG组（P＜0.05），见表3。

Figure 2.The pathological changes of cartilage tissues observed by safranine O staining（scale bar=50 μm）.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.图2 番红O染色观察软骨组织病理形态学

表3 各组软骨组织Mankin评分比较Table 3.Comparison of Mankin score of cartilage tissue in each group（Mean±SD.n=6）

4 BSHX对软骨组织TNF-α和IL-1β的影响

与control组相比，model组软骨组织中TNF-α和IL-1β 水平显著升高（P＜0.05）；与 model组相比，BSHX组软骨组织中TNF-α和IL-1β水平显著降低，SAG组软骨组织中TNF-α和IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG组软骨组织中TNF-α和IL-1β水平显著低于SAG组（P＜0.05），见表4。

表4 各组软骨组织中TNF-α和IL-1β水平比较Table 4.Comparison of TNF-α and IL-1β levels in cartilage tissue of each group（ng/L.Mean±SD.n=6）

5 BSHX对软骨组织MMP-13和Col-II表达的影响

与control组相比，model组软骨组织中MMP-13阳性表达率显著升高，而Col-II阳性表达率显著降低（P＜0.05）；与 model组相比，BSHX 组软骨组织中MMP-13阳性表达率显著降低，Col-II阳性表达率显著升高，SAG组软骨组织中MMP-13阳性表达率显著升高，Col-II阳性表达率显著降低（P＜0.05）；BSHX+SAG组软骨组织中MMP-13阳性表达率显著低于SAG组，Col-II阳性表达率显著高于SAG组（P＜0.05），见图3及表5。

Figure 3.Immunohistochemical staining for MMP-13 and Col-II expression in cartilage tissues（SP method，scale bar=100 μm）.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.图3 免疫组化检测软骨组织中MMP-13和Col-II的表达

表5 各组软骨组织MMP-13和Col-II阳性表达率的比较Table 5.Comparison of positive expression rates of MMP-13 and Col-II in cartilage tissue of each group（%.Mean±SD.n=6）

6 BSHX对软骨组织中Hedgehog通路表达的影响

与control组相比，model组软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与model组相比，BSHX组软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达显著降低，SAG组软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；BSHX+SAG组软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达显著低于SAG组（P＜0.05），见图4及表6。

Figure 4.The protein expression of Shh，Ptch1，Smo and Gli1 in cartilage tissues detected by Western blot.A：control group；B：model group；C：BSHX group；D：SAG group；E：BSHX+SAG group.图4 Western blot检测软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达

表6 各组软骨组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达比较Table 6 Comparison of protein expression of Shh，Ptch1，Smo and Gli1 in cartilage tissue of each group（Mean±SD.n=6）

讨 论

膝骨关节炎是以软骨变性、关节周围骨质增生为特征的慢性关节炎症性疾病［11］。本研究通过采用Hulth手术造模法复制兔膝骨关节炎模型，手术切除膝关节前交叉韧带、关节内侧副韧带等造成关节力学失稳，诱发膝骨关节炎，与临床发病机制相似［12］。本研究结果表明，与control组相比，model组兔出现膝关节肿胀、宽度增加、活动减小等膝骨关节炎典型特征。关节软骨退变为膝骨关节炎的主要病理特征，关节负重前侧软骨发生糜烂后，软骨细胞密度增高，随后软骨结构紊乱，潮线消失或上移。本研究显示，model组软骨退变评分和软骨分级显著升高，HE染色观察到软骨表面不平滑、粗糙，出现一定溃疡，结构不清晰，细胞排列紊乱，体积增大，潮线不清晰，细胞质基质染色变浅，Mankin评分显著升高，与以往膝关节炎动物病理检测结果相似［13］，提示兔膝骨关节炎模型制备成功。

膝骨关节炎在中医中属于骨痹、痹症、瘀证等范畴，中医认为膝部受风寒后滞于患处，长久凝集使筋脉损伤、痉挛，造成关节功能障碍，此外体虚、肝肾功能较弱会影响机体气血运行，造成气凝滞于关节，因此治疗该病的关键在于补肾活血［14］。补肾活血方主要由桑寄生、积血、熟地黄、龟板等组成，该方中熟地黄具有滋阴补血功效，丹参具有活血消肿的功效，整方具有补肾活血之功效。研究表明，BSHX能够提高骨性关节炎治疗效果，显著减轻患者关节疼痛程度［15］。本研究表明，与model组相比，BSHX组兔膝关节退变评分、软骨分级降低，HE染色显示关节软骨组织、细胞形态均得到一定缓解，细胞质基质染色变均匀，提示BSHX可减轻兔膝关节炎软骨损伤，延缓关节软骨退变，然而具体机制尚不清楚。

关节软骨细胞微环境由多型胶原、关节液及细胞外基质组成，其中Col-II是含量最高的胶原之一，正常生理状态下软骨细胞主要分泌Col-II，I型胶原（collagen type I，Col-I）分泌极少，而软骨受损后，细胞微环境发生变化，会导致胶原蛋白变化，造成Col-II含量降低，Col-I含量升高，进而改变软骨结构［16］。本研究显示model组Col-II蛋白阳性表达率显著降低，给予BSHX后Col-II蛋白阳性率明显升高，提示膝骨关节炎兔软骨组织结构发生异常，BSHX可以通过上调Col-II含量而促进软骨修复。炎症因子与膝骨关节炎的发生、发展密切相关。有研究证实，TNF-α和IL-Iβ活化后放大炎症反应，降低软骨组织中Col-II含量，诱导基质中MMP-13的释放，降解完整的Col-II［17］。本研究显示，model组 TNF-α和IL-Iβ 水平及MMP-13阳性表达率升高，给予BSHX后TNF-α和IL-Iβ水平及MMP-13阳性表达率降低，提示BSHX可能通过减弱软骨组织炎症反应，维持细胞外基质胶原平衡，发挥对软骨组织的保护作用。

Hedgehog通路与软骨组织的发育、增殖、分化等密切相关。该通路主要由4个部分组成，包括：Hh蛋白家族（Shh、Dhh和Ihh），跨膜受体Ptch1和Smo，转录因子Gli1。正常情况下Ptch1与Smo相互作用后抑制Smo活性，当Hh蛋白与Ptch1结合后能够解除Ptch1对Smo的抑制，引发通路活化，激活转录因子Gli1进入细胞核调节下游靶基因转录［18］。既往研究表明，Hedgehog通路异常激活与骨性关节炎的发生及软骨损伤程度相关［19］。Thompson 等［20］的研究表明，Shh蛋白在正常人的软骨中几乎不表达，在软骨损伤初期，该蛋白水平明显升高。动物研究报道，TGF-β II型受体显性负突变体小鼠软骨组织中Shh蛋白表达升高，同时小鼠出现软骨细胞肥大等与人骨关节炎损伤相似的表现［21］。Zhou等［22］通过动物研究表明，Hh通路蛋白表达越高，膝骨关节损伤越严重，而采用Hh信号通路抑制剂处理后大鼠软骨损伤减轻。本研究显示，与control组相比，model组Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达显著升高，给予BSHX干预后Shh、Ptch1、Smo和Gli1蛋白降低，推测BSHX可能通过抑制Hedgehog通路的活化，进而发挥对膝骨关节炎软骨损伤的保护作用。为证实这一推测，本研究采用Hedgehog通路激活剂SAG处理兔模型组，其结果表明，SAG组膝关节软骨损伤更严重，关节软骨退变评分和Mankin病理评分进一步升高，TNF-α、IL-1β和MMP-13表达升高，Hedgehog通路蛋白表达升高；而给予SAG联合BSHX处理后，兔膝关节软骨损伤有所减轻，关节软骨退变得到缓解，TNF-α、IL-1β和MMP-13表达降低，提示BSHX可通过抑制Hedgehog通路进而缓解膝骨关节炎兔软骨退变，抑制软骨细胞外基质胶原失衡，减弱炎症反应，发挥对软骨组织的保护作用。

综上所述，补肾活血方可抑制Hedgehog通路活化，延缓膝骨关节软骨退变，减弱关节炎症反应，维持软骨细胞外基质胶原平衡。这可能为膝骨关节炎治疗提供新的思路。然而膝骨关节炎发生机制较复杂，补肾活血方具体通过Hedgehog通路下游哪些靶基因发挥作用，尚待后续深入探究。